重组CC16蛋白质抑制香烟烟雾提取物诱导人支气管上皮细胞衰老的初步研究

目的探讨重组人CC16蛋白质(rhCC16)对香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)诱导的人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBECs)衰老的抑制作用及机制。方法CCK-8法检测CSE(0%、1%、2.5%、5%、7.5%和10%)及rhCC16(0、10、100、250和500 ng/mL)对HBECs细胞活力的影响;β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测对照组、CSE组以及CSE+rhCC16组细胞β-半乳糖苷酶活性;实时荧光定量PCR(qPCR)检测各组细胞P16、P21 mRNA表达水平;Western blot检测各组细胞P16、P21、p-P53、P38、p-P38、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达水平。结果与对照组相比,5%CSE刺激细胞72 h对HBECs细胞活力无显著影响;500 ng/mL及以下浓度rhCC16对HBECs细胞活力无显著影响;与对照组相比,5%CSE刺激HBECs细胞72 h致β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率明显升高(P<0.05),且P16和P21蛋白和mRNA表达水平明显升高(P<0.05),p-P53、p-P38与p-ERK1/2蛋白表达量显著增加(P<0.05);与CSE组相比,250 ng/mL rhCC16干预下,HBECs细胞β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率显著下降(P<0.05),P16和P21蛋白和mRNA表达水平显著下降(P<0.05),p-P53、p-p38和p-ERK1/2的表达量降低(P<0.05)。结论rhCC16蛋白质抑制香烟烟雾诱导的HBECs衰老,抑制P38 MAPK和ERK1/2信号通路可能是其作用机制。

miRNA-218通过靶向BRD4对香烟烟雾提取物诱导的COPD气道上皮细胞凋亡的调控作用

目的探讨miR-218通过靶向BRD4对香烟烟雾提取物(CSE)诱导的慢性阻塞性肺疾病(COPD)时气道上皮细胞凋亡的调控作用。方法将人肺支气管上皮细胞BEAS-2B分为正常对照(NC)组、CSE组、miR-NC+CSE组、miR-218+CSE组、si-NC+CSE组、si-BRD4+CSE组、miR-218+pcDNA-NC+CSE组和miR-218+pcDNA-BRD4+CSE组。通过对不同组细胞中miRNA、蛋白及炎症因子的检测和双荧光素酶报告基因实验共同验证miR-218对BRD4的靶向作用。结果与NC组比较,CSE组BEAS-2B细胞miR-218表达降低,细胞凋亡率、BRD4、Cleaved-caspase-3、IL-6和TGF-β1表达显著增加(均P<0.05)。与miR-NC+CS组比较,miR-218+CSE组BEAS-2B细胞凋亡率、Cleaved-caspase-3、IL-6和TGF-β1表达显著降低(均P<0.05);与si-NC+CSE组比较,si-BRD4+CSE组上述指标表达显著降低(P<0.05);与miR-218+pcDNA-NC+CSE组比较,miR-218+pcDNA-BRD4+CSE组上述指标表达显著增加(P<0.05)。结论miR-218通过靶向BRD4可抑制CSE诱导的气道上皮细胞凋亡,miR-218可能是慢性阻塞性肺疾病的潜在治疗靶点。

香烟烟雾提取物对人支气管上皮细胞中脂质代谢的影响研究

目的基于液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术研究香烟烟雾提取物(CSE)对人支气管上皮细胞(HBECs)中脂质代谢的影响。方法体外建立CSE干预HBECs模型,以5%CSE干预的支气管上皮细胞为实验组,以无CSE干预的细胞为对照组,采用LC-MS技术定量检测HBECs内的脂质成分,数据经主成分分析及正交偏最小二乘法判别分析,从728个脂质(11类脂质)中筛选出差异脂质。结果与对照组比较,实验组的HBECs显示出191个差异表达脂质,有185个脂质上调,6个脂质下调,其中增高数量比例最高的脂质为鞘脂途径脂质,增高倍数最大的脂质为甘油三酯。结论CSE可导致HBECs的脂质代谢紊乱,尤其是鞘脂途径脂质的积累,可能与慢性阻塞性肺疾病进程相关。

论返魂草联合半夏提取物对香烟烟雾诱发慢支的治疗效果

目前 探讨返魂草联合半夏提取物对香烟烟雾诱发慢支的治疗效果。方法 首先选择雄性豚鼠36只,并随机分为6组,每组6只,返魂草提取物组(19.0g kg-1);半夏提取物组(0.6g kg-1);联合组:(等体积等浓度);阳性对照组(核酪口服液给药组)(0.2mL10g-1);正常组和模型组均给予等量生理盐水。并每天灌胃1次,持续五天。灌胃结束后第2天处死全部豚鼠,分离暴露豚鼠气管与左右主支气管、肺组织标本。观察豚鼠肺组织中SOD、MDA、GSH-Px和CAT的变化以及BALF中白细胞的细胞学变化。结果 在肺组中,干预的SOD水平和CSH-Px水平都明显地低于对照组(P<0.05);联合给药组MDA水平高于正常对照组(P<0.05),低于模型组(P<0.05);返魂草提取物给药组,半夏提取物给药组,联合组BALF中性粒细胞、淋巴细胞比例与模型组相比均有大幅降低(P<0.05),而肺泡巨噬细胞比率提高(P<0.05)。结论 返魂草联合半夏提取物在一定程度上可以增强肺组织的抗氧化的能力。且聚义一定的保护作用。

香烟水溶性提取物对大鼠心肌线粒体的毒性

观察香烟水溶性提取物(CSE)和尼古丁对大鼠心肌线粒体的损伤作用.大鼠心肌线粒体分别与CSE或尼古丁于37℃温孵60min,结果表明,CSE明显降低线粒体细胞色素C氧化酶(COX)活性,呈剂量依赖性.但是ATPase活性不受影响.在线粒体呼吸活性受到抑制的同时,过氧化指标无明显变化.CSE对6.5mmol/L钙离子引起的线粒体肿胀反应具有抑制作用,但可加剧250mmol/L钙离子诱导的线粒体肿胀反应.维生素C对CSE造成的线粒体损伤无保护作用.未见尼古丁对体外大鼠心肌线粒体有毒性.CSE对心肌线粒体的损伤可能是由于它对呼吸酶活性的直接抑制作用而与氧自由基机制无关.尼古丁可能不是CSE损伤大鼠心肌线粒体的毒性成分.

一氧化氮对香烟烟雾提取物诱导大鼠肺泡巨噬细胞核因子κB活化的影响

目的:探讨一氧化氮(NO)对香烟烟雾提取物(CSE)诱导的大鼠肺泡巨噬细胞(AM)中核因子κB(NF—κB)活化的影响及机 制。方法:将大鼠AM与不同浓度的NO前体左旋精氨酸(L-Arg)或iNOS特异性抑制剂N6-(1-亚氨乙基)赖氨酸(L-NIL)及CSE共同培养,用免疫细胞化学染色法检测NF-κB,用Western blot检测I-κB蛋白含量,用Griess法测定培养上清液中NO的水平。结果:CSE可使NF-κB活化细胞的百分率增加,I-κB的水平下降。加入CSE和低浓度L-Arg培养的AM,NF-κB活化细胞的百分率显著高于只加入CSE的AM;而I-κB的水平显著低于只加入CSE的AM。加入CSE和高浓度L-Arg培养的AM,NF-κB活化细胞的百分率显著低于只加入CSE的AM,而I-κB的水平无显著变化。加入CSE和不同浓度的L-NIL培养的AM,NF-κB活化细胞的百分率显著低于只加入CSE的AM;而I-κB的水平则显著高于只加入CSE的AM,并呈浓度依赖(P<0.01)。结论:内源性NO对香烟烟雾所致NF-κB的活化具有双向调控作用。

香烟提取物对支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖的影响

目的:探讨香烟提取物(CSE)对支气管哮喘(简称哮喘)大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖作用及可能机制。方法:16只SD大鼠随机分为对照组和哮喘组,各8只。原代培养大鼠ASMCs,取第3-6代细胞,分为对照组、对照+CSE组、哮喘组、哮喘+CSE组、哮喘+CSE+嘧啶基-苯磺酰胺(GW8510,细胞周期蛋白依赖激酶-4抑制剂)组、哮喘+GW8510组。用流式细胞术、四甲基偶氮唑盐(MTT)法及增殖细胞核抗原(PCNA)免疫细胞化学技术检测ASMCs增殖;用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Westernblotting)检测细胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表达。结果:(1)哮喘组ASMCs与对照组ASMCs相比,在S+G2/M期比例、吸光度(A)值和PCNA表达率上明显增高,差异显著(P<0.01)。(2)哮喘组ASMCsS+G2/M期比例、吸光度(A)值和PCNA表达率分别为(18.30±1.12)%、0.512±0.110、(55.1±3.7)%;哮喘+CSE组分别为(32.12±1.17)%、0.801±0.210、(90.2±7.3)%;哮喘+CSE+GW8510组分别为(17.21±0.95)%、0.508±0.009、(54.3±4.8)%;哮喘+GW8510组分别为(11.16±1.48)%、0.345±0.078、(40.6±5.4)%。除哮喘组、哮喘+CSE+GW8510组两组比较差异无显著外,其余两两比较差异均显著(P<0.01)。(3)哮喘组、哮喘+CSE组、哮喘+CSE+GW8510组、哮喘+GW8510组ASMCscyclinD1mRNAA值比值和蛋白表达A值比值分别为0.236±0.045、0.271±0.002;0.369±0.124、0.379±0.002;0.231±0.075、0.261±0.002;0.165±0.064、0.193±0.002。除哮喘组、哮喘+CSE+GW8510组两组比较差异无显著外,其余两两比较差异均显著(P<0.01)。结论:正常与哮喘大鼠ASMCs在CSE干预后增殖明显加快,cyclinD1表达明显增加。CSE可能是通过cyclinD1参与调控哮喘大鼠ASMCs的增殖。

香烟烟雾提取物对人呼吸道上皮细胞DNA损伤和凋亡的影响

背景与目的:香烟烟雾可以致多种细胞发生DNA损伤已有报道证实。本研究旨在进一步阐明香烟烟雾提取物(cigarettesmokeextract,CSE)作用于正常人类支气管上皮细胞系(normalhumanbronchialepithelialcells,NHBE)和肺腺癌细胞系SPC-A1后引起的DNA损伤和凋亡情况。方法:不同浓度的CSE作用于NHBE和SPC-A1细胞,用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测两种细胞活性。荧光标记的磷酸化H2AX组蛋白(γ-H2AX)抗体特异性标记细胞核内DNA双链断裂(DNAdouble-strandbreaks,DSBs)处的γ-H2AX,然后用流式细胞仪定量检测并分析DNA损伤。用免疫印迹检测γ-H2AX表达。同时,亚G1峰法(SubG1peak)和AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶双染色流式细胞术检测CSE诱导的细胞凋亡。用激光共聚焦显微镜观察细胞损伤和凋亡形态学变化。结果:MTT结果显示,随CSE浓度和作用时间增加,细胞活性均逐渐降低。CSE可引起细胞DNA双链断裂,γ-H2AX最大值在作用后4h左右,然后逐渐降低。DNA损伤后平均12h可以出现凋亡。另外,激光共聚焦显微镜观察到两种细胞内的γ-H2AX量在细胞受到CSE刺激后快速大量的积聚,呈现典型细胞损伤的形态学变化,较为明显的凋亡形态学特征4h后方可出现。结论:CSE能直接引起NHBE和SPC-A1细胞的DNA损伤和凋亡,且存在着浓度和时间依赖关系。

香烟烟气提取物对原代皮肤成纤维细胞生长与凋亡的影响

[目的 ]探讨香烟烟气提取物 (Cigarettesmokeextract ,CSE)对原代皮肤成纤维细胞生长周期动力学和凋亡的影响。 [方法 ]采用噻唑盐 (MTT)吞噬试验、乳酸脱氢酶 (LDH)释放及流式细胞仪等技术研究 0 2 %～ 10 %的CSE对成纤维细胞生长、毒性及细胞周期动力学和凋亡发生率的影响。 [结果 ]CSE抑制细胞生长 ,LDH释放增加 ,并具有剂量反应关系。细胞周期动力学 ,表现为G2 /M期细胞数增加 (近 4倍 ) ;S期细胞数从 15 7%减少到 8 5 %。同时凋亡发生率由2 1%增至 2 3 0 %。 [结论 ]CSE抑制皮肤成纤维细胞生长 ,促进凋亡发生 ,G2 /M期生长阻滞可能是CSE作用皮肤细胞的主要环节。

香烟烟雾提取物致体外皮肤成纤维细胞损伤和对胶原合成的影响

目的探讨香烟烟雾提取物(CSE)对体外培养的皮肤成纤维细胞的损伤作用,观察CSE对成纤维细胞Ⅰ型胶原合成的影响作用。方法在光镜下观察染毒后细胞形态和结构的变化;采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测不同浓度的CSE在不同的时间对体外皮肤成纤维细胞存活力的影响,并绘制不同浓度下细胞的生长曲线;β-半乳糖苷酶染色方法检测CSE连续作用5代后成纤维细胞β-半乳糖苷酶的变化情况;流式细胞仪检测不同浓度的CSE作用下和不同染毒时间的细胞周期变化情况;RT-PCR检测不同浓度的CSE对成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA表达的影响。结果染毒后光镜下呈典型的损伤细胞形态;随着CSE染毒浓度的增大和时间的延长,细胞存活力明显下降;细胞生长曲线示各染毒组细胞生长速度较对照组明显减慢;染毒后细胞经5次传代后β-半乳糖苷酶染色呈明显的阳性,对照组染色为阴性;细胞周期动力学显示,随着作用浓度的增加和作用时间的延长,G1、G2期细胞数增加,S期细胞数减少;CSE作用后,成纤维细胞的Ⅰ型前胶原mRNA表达降低。结论CSE对体外成纤维细胞具有明显的损伤作用,对细胞的增殖和生长有一定的抑制作用;低浓度CSE长期作用的积累,使多次传代的成纤维细胞具有衰老细胞的特点;CSE能够抑制细胞活性,引起细胞DNA复制和有丝分裂障碍,对各期有不同程度的阻滞。CSE对成纤维细胞的胶原合成有一定抑制作用。

香烟烟雾提取物对大鼠肺组织的损伤作用及对一氧化氮生成的影响

将大鼠肺组织切片与香烟烟雾提取物（ＣＳＥ）共同孵育，测定其乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）活性、亚硝酸盐（ＮＯ_２） 含量、一氧化氮合酶（ＮＯＳ）活性及左旋精氨酸（Ｌ－Ａｒｇ）转运，以探讨吸烟对肺组织的氧化损伤作用及对一氧化氮 生成的影响。结果显示： １０％ ＣＳＥ时间依赖地增加大鼠肺组织 ＬＤＨ漏出及 ＮＯ_２释放，二者高度正相关（ｒ=０．６５， Ｐ＜０．０１），刺激诱导型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）活性增加，并通过增加最大转运速度（Ｖｍａｘ）使Ｌ－Ａｒｇ转运增加。提示：吸烟可 能通过增加 Ｌ－Ａｒｇ的跨膜转运使细胞内 Ｌ－Ａｒｇ浓度增高，并增加 ｉＮＯＳ活性使 ＮＯ过量产生。 ＮＯ可能参与了吸烟对肺 组织的损伤过程。

香烟提取物对气道平滑肌细胞增殖中ERKs及NF-κB表达的影响

目的探讨香烟提取物(cigarette smoke extract,CSE)对气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)增殖中细胞外信号调节蛋白激酶(ERKs)及核因子-κB(NF-κB)表达的影响。方法体外培养Wistar大鼠的气道平滑肌细胞,给予不同浓度的CSE刺激24 h后,MTT法检测细胞增殖情况,采用Western blot方法检测ERKs、磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(p-ERK)和NF-κB p65的表达。结果1/32 CSE组、1/16 CSE组及1/8 CSE组的细胞增殖和ERKs、p-ERK、NF-κB p65的表达均逐渐增高,且与对照组相比差异有显著性意义(P<0.05,n=4)。NF-κB p65的表达水平与p-ERK的表达水平呈明显正相关(r=0.858,P<0.05,n=4)。结论一定浓度的CSE作用于平滑肌细胞后引起ERKs及ERKs磷酸化的增加,磷酸化激活后的ERKs可能与NF-κB的活化和ASMCs的增殖有关。

香烟烟雾提取物通过氧化应激下调组蛋白去乙酰化酶2诱导小鼠骨骼肌细胞早衰

目的探讨香烟烟雾提取物(CSE)是否通过氧化应激减少抗衰老分子组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)的表达而诱导骨骼肌细胞早衰。方法诱导C2C12成肌细胞分化成骨骼肌细胞,观察CSE处理对骨骼肌细胞氧化应激、衰老和HDAC2表达的影响,应用氧化剂H2O2和抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)为工具药,检测细胞中丙二醛(MDA)含量、活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的变化,应用β半乳糖苷酶染色检测衰老细胞百分率,采用实时荧光定量PCR检测HDAC2 mRNA水平,Western blot法检测HDAC2蛋白水平。结果与对照组相比,CSE和H2O2可增加小鼠骨骼肌细胞MDA含量和ROS水平,而降低SOD、GSH-Px的活性,同时伴有β半乳糖苷酶的水平增加和抗衰老分子HDAC2 mRNA和蛋白水平的降低。NAC预处理后,可降低CSE诱导的MDA含量和ROS活性,提高SOD、GSH-Px的活性,同时β半乳糖苷酶表达降低,HDAC2的水平升高。结论 CSE可能是通过氧化应激降低HDAC2诱导小鼠骨骼肌细胞早衰。

不同剂量香烟烟雾提取物对阴茎海绵体NOS活性和Cx43蛋白的影响

目的:探讨不同剂量的香烟烟雾提取物对雄性大鼠勃起功能的影响,进一步研究吸烟导致ED的发病机制。方法:75只健康雄性SD大鼠(8周龄),随机分为5组(15只/组)。A组为对照组;B组为皮下注射二甲基亚砜(DMSO)组;C组为皮下注射香烟烟雾提取物(CSE)低剂量组;D组为皮下注射CSE中剂量组;E组为皮下注射CSE高剂量组。应用SD雄性大鼠建立皮下注射CSE模型60 d后,经皮下注射阿朴吗啡(APO)后观察大鼠阴茎勃起情况,处死大鼠取阴茎海绵体组织。一部分标本采用激光共聚焦扫描显微镜方法检测缝隙连接蛋白43(Cx43)的表达;另一部分标本采用比色法测定大鼠阴茎海绵体组织中NOS活性。结果:不同剂量CSE组阴茎勃起次数、阴茎海绵体组织NOS活性和海绵体平滑肌中Cx43表达与DMSO组和对照组比较均明显减少(P<0.05)。实验组中,阴茎勃起次数、阴茎海绵体组织NOS活性和Cx43表达均随着CSE剂量的增加而减少。DMSO组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:CSE使阴茎海绵体组织NOS活性明显降低、海绵体平滑肌中Cx43蛋白表达明显减少并且严重影响阴茎勃起功能,并且CSE剂量越大,其影响越明显。提示,Cx43蛋白表达下调、NOS活性降低可能是CSE导致ED的发病机制之一。

香烟烟雾提取物致人气道平滑肌细胞损伤及对白介素-8表达的影响

目的:观察香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)对人气道平滑肌细胞(human airway smooth muscle cells,HASMCs)的损伤及对白介素-8(interleukin-8,IL-8)表达水平的影响。方法:原代培养HASMCs,分为空白对照组、CSE组,在干预24h后使用倒置显微镜、MTT法观察HASMCs的活性,用ELISA法和RT-PCR法测定IL-8表达水平的变化。结果:CSE可导致HASMCs形态和结构的改变,同时使HASMCs分泌释放IL-8增加。结论:在香烟烟雾提取物刺激下,HASMCs分泌IL-8增加。

辛伐他汀对香烟烟雾提取物诱导的人脐静脉内皮细胞表达sEPCR和mEPCR的影响

目的:研究辛伐他汀对香烟烟雾提取物(CSE)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)表达可溶性内皮细胞蛋白C受体(sEPCR)和膜联内皮细胞蛋白C受体(mEPCR)的干预作用。方法:体外培养的4～6代HU-VECs随机分为对照组、5%CSE组、不同浓度辛伐他汀组及辛伐他汀干预组,辛伐他汀组分别加入50、100、200μmol/L辛伐他汀液孵育24 h,辛伐他汀干预组先以50、100、200μmol/L辛伐他汀预处理细胞2 h,再与5%CSE孵育24 h。收集各组细胞及上清液,ELISA法检测上清液中sEPCR蛋白含量,实时定量PCR法检测各组细胞中mEPCR mRNA的表达。结果:(1)5%CSE组sEPCR蛋白含量高于对照组,mEPCR mRNA表达低于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05);(2)100μmol/L与200μmol/L辛伐他汀组sEPCR蛋白含量均高于对照组,低于5%CSE组,其mEPCR mRNA表达均低于对照组,高于5%CSE组,差异均有统计学意义(均P<0.05);(3)各辛伐他汀干预组sEPCR蛋白含量均低于5%CSE组,但高于对照组及相应浓度的辛伐他汀组;相反,各辛伐他汀干预组mEPCR mRNA表达均高于5%CSE组,低于对照组及相应浓度的辛伐他汀组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:在体外,辛伐他汀通过上调HUVECs mEPCR mRNA的表达,降低sEPCR的分泌,对CSE介导的内皮细胞凝血功能障碍可能具有一定的改善作用。

羟基红花黄色素A对香烟提取物诱导A549细胞炎症因子表达作用的研究

目的:探讨羟基红花黄色素A(HSYA)抑制香烟烟雾提取物(CSE)诱导的A549肺泡上皮细胞炎症介质表达升高的作用。方法:用CSE刺激A549肺泡上皮细胞建立损伤模型,细胞分七组:单纯HSYA组、Sham组、CSE组、CSE+HSYA低剂量组(1μmol/L)、CSE+HSYA中剂量组(4μmol/L)、CSE+HSYA高剂量组(16μmol/L)和CSE+阳性对照药红霉素(5μg/mL)组。以RT-qPCR技术检测白介素(IL)-6、白介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、细胞间黏附分子(ICAM)-1和血管细胞黏附分子(VCAM)-1 mRNA的表达水平;ELISA法检测细胞培养液中IL-6、IL-1β及TNF-α的蛋白水平表达;蛋白质印迹法(western blot)检测细胞p38MAPK磷酸化的水平。结果:与Sham组相比,CSE组IL-6、IL-1β、TNF-α、ICAM-1和VCAM-1 mRNA水平均明显升高(P<0.001),给予不同浓度的HSYA后炎症因子的高表达受到抑制,红霉素组也见较明显的抑制。与Sham组相比,CSE组细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白的表达水平明显升高(P<0.001),给予不同浓度的HSYA后CSE所诱发的炎症因子的高表达受到抑制,红霉素组也见较明显的抑制。与Sham组比较,CSE组的p38 MAPK的磷酸化水平明显升高(P<0.001),给予不同浓度的HSYA后细胞p38 MAPK的磷酸化水平升高受到抑制,红霉素组也可见明显的抑制。结论:HSYA可抑制CSE诱导A549细胞的炎症因子的表达升高。

番茄红素抑制香烟烟雾提取物刺激巨噬细胞所致的炎症反应

【目的】探讨番茄红素对香烟烟雾提取物(CSE)所诱导的人单核细胞株(THP-1)巨噬细胞炎症因子生成的影响及其作用的分子机制。【方法】用100μg/L佛波酯(PMA)诱导THP-1细胞48 h,使其分化为巨噬细胞后,分为空白组、CSE组和CSE+不同浓度番茄红素组(0.5、1和2μmol/L)。采用ELISA法检测THP-1巨噬细胞培养基中白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量,荧光探针DCFH-DA测定细胞内活性氧(ROS)生成水平,Western-blotting检测核p65的蛋白表达量。【结果】CSE诱导THP-1巨噬细胞后,IL-6和TNF-α合成释放水平升高,番茄红素可降低CSE诱导引起IL-6和TNF-α生成水平升高。CSE刺激后细胞内ROS生成及核p65蛋白表达增加,核因子-κB(NF-κB)活化,番茄红素可拮抗以上作用,阻止NF-κB活化。【结论】番茄红素能够有效抑制CSE诱导THP-1巨噬细胞炎症反应,该作用主要通过阻断CSE诱导细胞内ROS生成进而抑制NF-κB依赖的炎症因子IL-6和TNF-α分泌发挥的,这可能是番茄红素抑制吸烟导致的炎症反应的作用机制之一。

自噬参与香烟烟雾提取物诱导的肺动脉内皮细胞凋亡

目的:探讨自噬在香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)诱导人肺动脉内皮细胞(human pulmonary artery endothelial cells,HPAECs)凋亡中的作用。方法:常规培养HPAECs,分为对照组、CSE组、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)组和3-MA+CSE组,应用Hoechst 33342染色和Annexin V/PI流式细胞术检测细胞凋亡,单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)染色观察细胞自噬泡形成,Western bolt测定自噬相关蛋白beclin-1、LC3与cleaved caspase-3的水平。结果:MDC染色示CSE处理可以诱导细胞产生自噬泡,Western blot结果示自噬相关蛋白LC3及beclin-1表达升高,3-MA预处理后抑制上述蛋白的表达。Hoechst 33342染色和Annexin V/PI流式结果显示CSE组细胞凋亡率较对照组明显增加,在3-MA+CSE组,细胞凋亡率较CSE组进一步升高;同时,CSE组细胞cleaved caspase-3蛋白水平较对照组明显升高(P<0.05),3-MA+CSE组的caspase-3表达较CSE组进一步升高。结论:CSE能诱导HPAECs发生自噬和凋亡,抑制自噬能够进一步促进CSE对HPAECs的凋亡作用,这种作用可通过激活caspase-3实现。

香烟烟雾提取物对肺泡Ⅱ型上皮细胞核因子-κB及肿瘤坏死因子的影响

目的观察香烟烟雾提取物(CSE)对肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549)的损伤、对核因子-κB(NF-κB)和肿瘤坏死因子(TNFα)的影响。方法体外培养A549,加入不同浓度的CSE,应用倒置显微镜、MTT法、免疫组化染色和ELISA法观察A549细胞形态、活性、NF-κB活化和TNFα水平的变化。结果与对照组相比,A549细胞的镜下形态和结构随CSE浓度和时间发生改变;MTT示各组间差异有显著性(P<0.01);不同浓度CSE刺激后均可诱导NF-κB的活化,且在8h达高峰;各组TNFα水平具时间依赖性,其中5%和10%CSE组上升,20%CSE组下降(P均<0.01)。结论CSE可导致A549形态结构改变和活性下降,其损伤可能与NF-κB活化和TNFα水平变化有关。