重组CC16蛋白质抑制香烟烟雾提取物诱导人支气管上皮细胞衰老的初步研究

目的探讨重组人CC16蛋白质(rhCC16)对香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)诱导的人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBECs)衰老的抑制作用及机制。方法CCK-8法检测CSE(0%、1%、2.5%、5%、7.5%和10%)及rhCC16(0、10、100、250和500 ng/mL)对HBECs细胞活力的影响;β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测对照组、CSE组以及CSE+rhCC16组细胞β-半乳糖苷酶活性;实时荧光定量PCR(qPCR)检测各组细胞P16、P21 mRNA表达水平;Western blot检测各组细胞P16、P21、p-P53、P38、p-P38、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达水平。结果与对照组相比,5%CSE刺激细胞72 h对HBECs细胞活力无显著影响;500 ng/mL及以下浓度rhCC16对HBECs细胞活力无显著影响;与对照组相比,5%CSE刺激HBECs细胞72 h致β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率明显升高(P<0.05),且P16和P21蛋白和mRNA表达水平明显升高(P<0.05),p-P53、p-P38与p-ERK1/2蛋白表达量显著增加(P<0.05);与CSE组相比,250 ng/mL rhCC16干预下,HBECs细胞β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率显著下降(P<0.05),P16和P21蛋白和mRNA表达水平显著下降(P<0.05),p-P53、p-p38和p-ERK1/2的表达量降低(P<0.05)。结论rhCC16蛋白质抑制香烟烟雾诱导的HBECs衰老,抑制P38 MAPK和ERK1/2信号通路可能是其作用机制。

miRNA-218通过靶向BRD4对香烟烟雾提取物诱导的COPD气道上皮细胞凋亡的调控作用

目的探讨miR-218通过靶向BRD4对香烟烟雾提取物(CSE)诱导的慢性阻塞性肺疾病(COPD)时气道上皮细胞凋亡的调控作用。方法将人肺支气管上皮细胞BEAS-2B分为正常对照(NC)组、CSE组、miR-NC+CSE组、miR-218+CSE组、si-NC+CSE组、si-BRD4+CSE组、miR-218+pcDNA-NC+CSE组和miR-218+pcDNA-BRD4+CSE组。通过对不同组细胞中miRNA、蛋白及炎症因子的检测和双荧光素酶报告基因实验共同验证miR-218对BRD4的靶向作用。结果与NC组比较,CSE组BEAS-2B细胞miR-218表达降低,细胞凋亡率、BRD4、Cleaved-caspase-3、IL-6和TGF-β1表达显著增加(均P<0.05)。与miR-NC+CS组比较,miR-218+CSE组BEAS-2B细胞凋亡率、Cleaved-caspase-3、IL-6和TGF-β1表达显著降低(均P<0.05);与si-NC+CSE组比较,si-BRD4+CSE组上述指标表达显著降低(P<0.05);与miR-218+pcDNA-NC+CSE组比较,miR-218+pcDNA-BRD4+CSE组上述指标表达显著增加(P<0.05)。结论miR-218通过靶向BRD4可抑制CSE诱导的气道上皮细胞凋亡,miR-218可能是慢性阻塞性肺疾病的潜在治疗靶点。

香烟烟雾提取物对人支气管上皮细胞中脂质代谢的影响研究

目的基于液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术研究香烟烟雾提取物(CSE)对人支气管上皮细胞(HBECs)中脂质代谢的影响。方法体外建立CSE干预HBECs模型,以5%CSE干预的支气管上皮细胞为实验组,以无CSE干预的细胞为对照组,采用LC-MS技术定量检测HBECs内的脂质成分,数据经主成分分析及正交偏最小二乘法判别分析,从728个脂质(11类脂质)中筛选出差异脂质。结果与对照组比较,实验组的HBECs显示出191个差异表达脂质,有185个脂质上调,6个脂质下调,其中增高数量比例最高的脂质为鞘脂途径脂质,增高倍数最大的脂质为甘油三酯。结论CSE可导致HBECs的脂质代谢紊乱,尤其是鞘脂途径脂质的积累,可能与慢性阻塞性肺疾病进程相关。

一氧化氮对香烟烟雾提取物诱导大鼠肺泡巨噬细胞核因子κB活化的影响

目的:探讨一氧化氮(NO)对香烟烟雾提取物(CSE)诱导的大鼠肺泡巨噬细胞(AM)中核因子κB(NF—κB)活化的影响及机 制。方法:将大鼠AM与不同浓度的NO前体左旋精氨酸(L-Arg)或iNOS特异性抑制剂N6-(1-亚氨乙基)赖氨酸(L-NIL)及CSE共同培养,用免疫细胞化学染色法检测NF-κB,用Western blot检测I-κB蛋白含量,用Griess法测定培养上清液中NO的水平。结果:CSE可使NF-κB活化细胞的百分率增加,I-κB的水平下降。加入CSE和低浓度L-Arg培养的AM,NF-κB活化细胞的百分率显著高于只加入CSE的AM;而I-κB的水平显著低于只加入CSE的AM。加入CSE和高浓度L-Arg培养的AM,NF-κB活化细胞的百分率显著低于只加入CSE的AM,而I-κB的水平无显著变化。加入CSE和不同浓度的L-NIL培养的AM,NF-κB活化细胞的百分率显著低于只加入CSE的AM;而I-κB的水平则显著高于只加入CSE的AM,并呈浓度依赖(P<0.01)。结论:内源性NO对香烟烟雾所致NF-κB的活化具有双向调控作用。

香烟烟雾提取物对人呼吸道上皮细胞DNA损伤和凋亡的影响

背景与目的:香烟烟雾可以致多种细胞发生DNA损伤已有报道证实。本研究旨在进一步阐明香烟烟雾提取物(cigarettesmokeextract,CSE)作用于正常人类支气管上皮细胞系(normalhumanbronchialepithelialcells,NHBE)和肺腺癌细胞系SPC-A1后引起的DNA损伤和凋亡情况。方法:不同浓度的CSE作用于NHBE和SPC-A1细胞,用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测两种细胞活性。荧光标记的磷酸化H2AX组蛋白(γ-H2AX)抗体特异性标记细胞核内DNA双链断裂(DNAdouble-strandbreaks,DSBs)处的γ-H2AX,然后用流式细胞仪定量检测并分析DNA损伤。用免疫印迹检测γ-H2AX表达。同时,亚G1峰法(SubG1peak)和AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶双染色流式细胞术检测CSE诱导的细胞凋亡。用激光共聚焦显微镜观察细胞损伤和凋亡形态学变化。结果:MTT结果显示,随CSE浓度和作用时间增加,细胞活性均逐渐降低。CSE可引起细胞DNA双链断裂,γ-H2AX最大值在作用后4h左右,然后逐渐降低。DNA损伤后平均12h可以出现凋亡。另外,激光共聚焦显微镜观察到两种细胞内的γ-H2AX量在细胞受到CSE刺激后快速大量的积聚,呈现典型细胞损伤的形态学变化,较为明显的凋亡形态学特征4h后方可出现。结论:CSE能直接引起NHBE和SPC-A1细胞的DNA损伤和凋亡,且存在着浓度和时间依赖关系。

不同剂量香烟烟雾提取物对阴茎海绵体NOS活性和Cx43蛋白的影响

目的:探讨不同剂量的香烟烟雾提取物对雄性大鼠勃起功能的影响,进一步研究吸烟导致ED的发病机制。方法:75只健康雄性SD大鼠(8周龄),随机分为5组(15只/组)。A组为对照组;B组为皮下注射二甲基亚砜(DMSO)组;C组为皮下注射香烟烟雾提取物(CSE)低剂量组;D组为皮下注射CSE中剂量组;E组为皮下注射CSE高剂量组。应用SD雄性大鼠建立皮下注射CSE模型60 d后,经皮下注射阿朴吗啡(APO)后观察大鼠阴茎勃起情况,处死大鼠取阴茎海绵体组织。一部分标本采用激光共聚焦扫描显微镜方法检测缝隙连接蛋白43(Cx43)的表达;另一部分标本采用比色法测定大鼠阴茎海绵体组织中NOS活性。结果:不同剂量CSE组阴茎勃起次数、阴茎海绵体组织NOS活性和海绵体平滑肌中Cx43表达与DMSO组和对照组比较均明显减少(P<0.05)。实验组中,阴茎勃起次数、阴茎海绵体组织NOS活性和Cx43表达均随着CSE剂量的增加而减少。DMSO组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:CSE使阴茎海绵体组织NOS活性明显降低、海绵体平滑肌中Cx43蛋白表达明显减少并且严重影响阴茎勃起功能,并且CSE剂量越大,其影响越明显。提示,Cx43蛋白表达下调、NOS活性降低可能是CSE导致ED的发病机制之一。

香烟烟雾提取物致体外皮肤成纤维细胞损伤和对胶原合成的影响

目的探讨香烟烟雾提取物(CSE)对体外培养的皮肤成纤维细胞的损伤作用,观察CSE对成纤维细胞Ⅰ型胶原合成的影响作用。方法在光镜下观察染毒后细胞形态和结构的变化;采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测不同浓度的CSE在不同的时间对体外皮肤成纤维细胞存活力的影响,并绘制不同浓度下细胞的生长曲线;β-半乳糖苷酶染色方法检测CSE连续作用5代后成纤维细胞β-半乳糖苷酶的变化情况;流式细胞仪检测不同浓度的CSE作用下和不同染毒时间的细胞周期变化情况;RT-PCR检测不同浓度的CSE对成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA表达的影响。结果染毒后光镜下呈典型的损伤细胞形态;随着CSE染毒浓度的增大和时间的延长,细胞存活力明显下降;细胞生长曲线示各染毒组细胞生长速度较对照组明显减慢;染毒后细胞经5次传代后β-半乳糖苷酶染色呈明显的阳性,对照组染色为阴性;细胞周期动力学显示,随着作用浓度的增加和作用时间的延长,G1、G2期细胞数增加,S期细胞数减少;CSE作用后,成纤维细胞的Ⅰ型前胶原mRNA表达降低。结论CSE对体外成纤维细胞具有明显的损伤作用,对细胞的增殖和生长有一定的抑制作用;低浓度CSE长期作用的积累,使多次传代的成纤维细胞具有衰老细胞的特点;CSE能够抑制细胞活性,引起细胞DNA复制和有丝分裂障碍,对各期有不同程度的阻滞。CSE对成纤维细胞的胶原合成有一定抑制作用。

番茄红素抑制香烟烟雾提取物刺激巨噬细胞所致的炎症反应

【目的】探讨番茄红素对香烟烟雾提取物(CSE)所诱导的人单核细胞株(THP-1)巨噬细胞炎症因子生成的影响及其作用的分子机制。【方法】用100μg/L佛波酯(PMA)诱导THP-1细胞48 h,使其分化为巨噬细胞后,分为空白组、CSE组和CSE+不同浓度番茄红素组(0.5、1和2μmol/L)。采用ELISA法检测THP-1巨噬细胞培养基中白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量,荧光探针DCFH-DA测定细胞内活性氧(ROS)生成水平,Western-blotting检测核p65的蛋白表达量。【结果】CSE诱导THP-1巨噬细胞后,IL-6和TNF-α合成释放水平升高,番茄红素可降低CSE诱导引起IL-6和TNF-α生成水平升高。CSE刺激后细胞内ROS生成及核p65蛋白表达增加,核因子-κB(NF-κB)活化,番茄红素可拮抗以上作用,阻止NF-κB活化。【结论】番茄红素能够有效抑制CSE诱导THP-1巨噬细胞炎症反应,该作用主要通过阻断CSE诱导细胞内ROS生成进而抑制NF-κB依赖的炎症因子IL-6和TNF-α分泌发挥的,这可能是番茄红素抑制吸烟导致的炎症反应的作用机制之一。

辛伐他汀对香烟烟雾提取物诱导的人脐静脉内皮细胞表达sEPCR和mEPCR的影响

目的:研究辛伐他汀对香烟烟雾提取物(CSE)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)表达可溶性内皮细胞蛋白C受体(sEPCR)和膜联内皮细胞蛋白C受体(mEPCR)的干预作用。方法:体外培养的4～6代HU-VECs随机分为对照组、5%CSE组、不同浓度辛伐他汀组及辛伐他汀干预组,辛伐他汀组分别加入50、100、200μmol/L辛伐他汀液孵育24 h,辛伐他汀干预组先以50、100、200μmol/L辛伐他汀预处理细胞2 h,再与5%CSE孵育24 h。收集各组细胞及上清液,ELISA法检测上清液中sEPCR蛋白含量,实时定量PCR法检测各组细胞中mEPCR mRNA的表达。结果:(1)5%CSE组sEPCR蛋白含量高于对照组,mEPCR mRNA表达低于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05);(2)100μmol/L与200μmol/L辛伐他汀组sEPCR蛋白含量均高于对照组,低于5%CSE组,其mEPCR mRNA表达均低于对照组,高于5%CSE组,差异均有统计学意义(均P<0.05);(3)各辛伐他汀干预组sEPCR蛋白含量均低于5%CSE组,但高于对照组及相应浓度的辛伐他汀组;相反,各辛伐他汀干预组mEPCR mRNA表达均高于5%CSE组,低于对照组及相应浓度的辛伐他汀组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:在体外,辛伐他汀通过上调HUVECs mEPCR mRNA的表达,降低sEPCR的分泌,对CSE介导的内皮细胞凝血功能障碍可能具有一定的改善作用。

香烟烟雾提取物对大鼠肺组织的损伤作用及对一氧化氮生成的影响

将大鼠肺组织切片与香烟烟雾提取物（ＣＳＥ）共同孵育，测定其乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）活性、亚硝酸盐（ＮＯ_２） 含量、一氧化氮合酶（ＮＯＳ）活性及左旋精氨酸（Ｌ－Ａｒｇ）转运，以探讨吸烟对肺组织的氧化损伤作用及对一氧化氮 生成的影响。结果显示： １０％ ＣＳＥ时间依赖地增加大鼠肺组织 ＬＤＨ漏出及 ＮＯ_２释放，二者高度正相关（ｒ=０．６５， Ｐ＜０．０１），刺激诱导型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）活性增加，并通过增加最大转运速度（Ｖｍａｘ）使Ｌ－Ａｒｇ转运增加。提示：吸烟可 能通过增加 Ｌ－Ａｒｇ的跨膜转运使细胞内 Ｌ－Ａｒｇ浓度增高，并增加 ｉＮＯＳ活性使 ＮＯ过量产生。 ＮＯ可能参与了吸烟对肺 组织的损伤过程。

自噬参与香烟烟雾提取物诱导的肺动脉内皮细胞凋亡

目的:探讨自噬在香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)诱导人肺动脉内皮细胞(human pulmonary artery endothelial cells,HPAECs)凋亡中的作用。方法:常规培养HPAECs,分为对照组、CSE组、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)组和3-MA+CSE组,应用Hoechst 33342染色和Annexin V/PI流式细胞术检测细胞凋亡,单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)染色观察细胞自噬泡形成,Western bolt测定自噬相关蛋白beclin-1、LC3与cleaved caspase-3的水平。结果:MDC染色示CSE处理可以诱导细胞产生自噬泡,Western blot结果示自噬相关蛋白LC3及beclin-1表达升高,3-MA预处理后抑制上述蛋白的表达。Hoechst 33342染色和Annexin V/PI流式结果显示CSE组细胞凋亡率较对照组明显增加,在3-MA+CSE组,细胞凋亡率较CSE组进一步升高;同时,CSE组细胞cleaved caspase-3蛋白水平较对照组明显升高(P<0.05),3-MA+CSE组的caspase-3表达较CSE组进一步升高。结论:CSE能诱导HPAECs发生自噬和凋亡,抑制自噬能够进一步促进CSE对HPAECs的凋亡作用,这种作用可通过激活caspase-3实现。

香烟烟雾提取物致人气道平滑肌细胞损伤及对白介素-8表达的影响

目的:观察香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)对人气道平滑肌细胞(human airway smooth muscle cells,HASMCs)的损伤及对白介素-8(interleukin-8,IL-8)表达水平的影响。方法:原代培养HASMCs,分为空白对照组、CSE组,在干预24h后使用倒置显微镜、MTT法观察HASMCs的活性,用ELISA法和RT-PCR法测定IL-8表达水平的变化。结果:CSE可导致HASMCs形态和结构的改变,同时使HASMCs分泌释放IL-8增加。结论:在香烟烟雾提取物刺激下,HASMCs分泌IL-8增加。

香烟烟雾提取物对肺泡Ⅱ型上皮细胞核因子-κB及肿瘤坏死因子的影响

目的观察香烟烟雾提取物(CSE)对肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549)的损伤、对核因子-κB(NF-κB)和肿瘤坏死因子(TNFα)的影响。方法体外培养A549,加入不同浓度的CSE,应用倒置显微镜、MTT法、免疫组化染色和ELISA法观察A549细胞形态、活性、NF-κB活化和TNFα水平的变化。结果与对照组相比,A549细胞的镜下形态和结构随CSE浓度和时间发生改变;MTT示各组间差异有显著性(P<0.01);不同浓度CSE刺激后均可诱导NF-κB的活化,且在8h达高峰;各组TNFα水平具时间依赖性,其中5%和10%CSE组上升,20%CSE组下降(P均<0.01)。结论CSE可导致A549形态结构改变和活性下降,其损伤可能与NF-κB活化和TNFα水平变化有关。

香烟烟雾提取物抑制树突状细胞诱导CD4^+T细胞分化为CD4^+CD25^+Foxp3^+调节性T细胞

目的探讨香烟烟雾提取物(CSE)暴露及抑制CD40-CD40L路径对小鼠髓源性树突状细胞(BMDC)诱导CD4^+T细胞分化为CD4^+CD25^+Foxp3^+调节性T细胞(Treg)的影响。方法使用40 ng/m L重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rm GM-CSF)和10 ng/m L重组小鼠白细胞介素4(rm IL-4)联合诱导无特定病原体级健康雄性BALB/c小鼠骨髓来源的单个核细胞分化为树突状细胞(DC),流式细胞术检测小鼠BMDC表面CD40分子的表达,再采用免疫磁珠分选的方法从BALB/c小鼠脾脏细胞分离出CD4^+T细胞。将所培养出的小鼠BMDC与正常对照组小鼠脾脏细胞分选的CD4^+T细胞共培养,加入CSE及拮抗性CD40抗体,作用24 h;流式细胞术观察各组细胞CD4^+CD25^+Foxp3^+Treg的变化,液相芯片技术检测细胞上清液白细胞介素10(IL-10)、IL-6的水平。结果 BMDC与CD4^+T淋巴细胞共培养可以促进CD4^+CD25^+Foxp3^+Treg分化,经CSE刺激后,流式细胞术检测显示小鼠BMDC与CD4^+T细胞共培养后分化的CD4^+CD25^+Foxp3^+Treg数量降低,细胞上清液IL-10降低、IL-6的水平升高;而加入拮抗性CD40抗体细胞共培养组CD4^+CD25^+Foxp3^+Treg增加,液相芯片检测细胞上清液IL-10上升、IL-6的水平下降。结论 CSE减少CD4^+CD25^+Foxp3^+Treg数量,体外使用拮抗性抗CD40抗体阻断CD40-CD40L通路可以促进CD4^+T细胞分化为CD4^+CD25^+Foxp3^+Treg。

姜黄素抑制香烟烟雾提取物刺激巨噬细胞RAW264.7所致炎症反应

目的研究姜黄素对香烟烟雾提取物刺激巨噬细胞株RAW264.7所致炎症反应的抑制作用。方法将RAW264.7巨噬细胞株培养于含不同浓度香烟烟雾提取物或姜黄素的培养基,MTT法筛选合适的实验浓度;组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A或香烟烟雾提取物分别刺激RAW264.7细胞株,体外模拟COPD发病的炎症反应过程;应用姜黄素和/或地塞米松处理被曲古抑菌素A或香烟烟雾提取物活化的RAW264.7细胞株;ELISA法测定细胞培养上清中炎症因子TNF-α、IL-6的表达水平。结果与空白对照组比较,曲古抑菌素A或香烟烟雾提取物均可显著上调巨噬细胞株RAW264.7的TNF-α、IL-6表达;应用姜黄素或地塞米松干预,可抑制炎症因子TNF-α和IL-6的表达上调;联合应用姜黄素与地塞米松具有更强的抗炎作用。结论姜黄素可抑制香烟烟雾提取物导致的巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-6分泌增加,可增强地塞米松的抗炎作用,其作用机制可能与姜黄素活化组蛋白去乙酰化酶有关。

香烟烟雾提取物对人内皮细胞细胞间黏附分子-1和白介素-8表达以及与多形核中性粒细胞黏附的影响

目的探讨香烟烟雾提取物(CSE)诱导作用对人内皮细胞细胞间黏附分子-1(ICAM-I)和白介素-8(IL-8)表达以及与多形核中性粒细胞(PMN)黏附的影响。方法培养人脐静脉内皮细胞株(ECV-304);制备香烟烟雾提取物(CSE);用不同浓度(0、2.5%、5.0%、10.0%)CSE刺激内皮细胞,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测不同时间点(1h、3h、6h、9h、12h、24h、48h)收集的细胞培养上清液IL-8的浓度,细胞免疫化学染色(SABC)检测ICAM-1在不同时间点(3h、6h、9h、12h)内皮细胞上的表达,细胞记数法测定(1h、3h、6h、9h、12h)后PMN与内皮细胞的黏附率(PMN-EC)。结果(1)各CSE浓度组干预12h后,ICAM-1在EC上的表达量随着干预浓度的增加而增高,除了2.5%CSE干预组和5.0%CSE干预组之间无差异外,各组间差异均有非常显著性意义(P<0.01);10.0%CSE干预不同时间点后,随着干预时间的延长,ICAM-1在内皮细胞上的表达量增加,各时间组之间差异均有非常显著性意义(P<0.01)。(2)随着CSE干预浓度的增加和干预时间的延长,内皮细胞表达IL-8的浓度增高,各组间差异均有非常显著性意义(P<0.01)。(3)各CSE浓度组干预12h后,PMN-EC黏附率随着干预浓度的增加而增加,各组间差异均有非常显著性意义(P<0.01)。10.0%CSE干预不同时间点后,随着干预时间的延长,PMN-EC黏附率增加,各时间组差异均有非常显著性意义(P<0.01)。结论香烟烟雾提取物可以刺激激活血管内皮细胞ICAM-1和IL-8表达,增强PMN与内皮细胞的黏附。

COPD患者外周血中性粒细胞表面PSGL-1、CD44的表达以及香烟烟雾提取物对其表达的影响

目的探讨P-选择素糖蛋白配体1(P-selectin glycoprotein ligand 1,PSGL-1)和CD44在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)患者外周血中性粒细胞中的表达,以及香烟烟雾提取物对健康志愿者外周血中性粒细胞PSGL-1和CD44表达的影响。方法收集华中科技大学同济医学院附属同济医院2015年9月至2015年12月呼吸与危重症医学科收治的26例COPD患者(COPD组),以及24例无吸烟史的健康志愿者作为正常对照组(NC组),流式细胞术检测COPD患者和健康志愿者外周血中性粒细胞表面PSGL-1和CD44的表达。同时分离6例健康无吸烟史的志愿者外周血标本中的中性粒细胞,用不同浓度(0%、5%、10%、20%)香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)刺激,流式细胞术检测中性粒细胞表面PSGL-1和CD44的表达。结果 COPD组患者外周血中性粒细胞表面PSGL-1、CD44的表达较NC组明显增强(均P<0.05),CSE刺激的正常人外周血中性粒细胞表面PSGL-1、CD44表达明显增强(均P<0.05),且呈浓度依赖性。结论 COPD患者外周血中性粒细胞表面PSGL-1和CD44的表达较正常对照组增强。香烟烟雾提取物可能通过促进外周血中性粒细胞表面PSGL-1和CD44的表达,从而启动中性粒细胞的粘附级联反应,促进气道中性粒细胞炎症反应。

TGF-β在香烟烟雾提取物诱导的中性粒细胞内质网应激中的作用

目的探讨TGF-β在香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)诱导的正常人外周血中性粒细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)中的作用。方法实验分3组:正常对照组、CSE刺激组、CSE刺激+内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate,4-PBA)组。培养正常人外周血中性粒细胞,给予不同浓度的CSE刺激16h,流式细胞术检测中性粒细胞GRP78、TGF-β、NF-κB、ERK、p38-MAPK的表达,ELISA法检测CXCL-8蛋白表达水平。结果 CSE增强中性粒细胞GRP78及TGF-β的表达,并在一定范围内呈浓度依赖性;内质网应激抑制剂4-PBA减少CXCL-8的分泌(P<0.05)和TGF-β的表达(P<0.05)。CSE对中性粒细胞表面NF-κB、ERK、p38-MAPK的表达无明显作用。结论 CSE诱导中性粒细胞内质网应激,并上调CXCL-8和TGF-β水平;4-PBA减少中性粒细胞分泌CXCL-8,可能与下调TGF-β表达有关。

香烟烟雾提取物对小鼠精子活力的影响

目的探讨香烟烟雾中所含外源活性氧物质(ROS)对小鼠精子活力的影响。方法香烟燃点后烟雾溶于二甲亚砜,配制成高ROS含量的香烟烟雾浓缩物(CSC)。釆用4周龄C57BL/6J小鼠45只,实验设置对照组(0mg/ml CSC)、低剂量组(0.2mg/ml CSC)和高剂量组(2.0mg/ml CSC)。连续饲喂含有CSC的饮用水4周,观察小鼠的生殖系统发育情况和可能的全身毒性反应,并检测肝功能指标。处死小鼠后即刻检测精子浓度和活力,检测睾丸内抗氧化酶类的表达水平,并制片观察睾丸组织病理变化。结果与对照组相比,低剂量和高剂量组小鼠精子浓度无显著变化,但高剂量组精子活力呈现显著下降。CSC低剂量组和高剂量组小鼠连续饲喂4周后精子总活动力分别为32%和19%,A级活动精子分别为13%和12%,均显著低于对照组(61%和24%)(P<0.05)。但在本实验剂量范围内,CSC对小鼠发育和生殖系统无明显毒性损伤,对睾丸抗氧化基因表达无显著影响。结论 CSC对小鼠精子活力有显著影响,但是对小鼠全身和生殖系统无明显毒性作用。CSC饲喂法可推荐用于诱导小鼠弱精子症模型。

沉默NLRP3炎性小体表达降低香烟烟雾提取物导致的人肺动脉内皮细胞凋亡

目的探讨NLPR3炎性小体(含NLR家族pyrin结构域蛋白3)对香烟烟雾提取物(CSE)诱导人肺动脉内皮细胞(HPAECs)凋亡的影响。方法用NLRP3 siRNA和NC siRNA(阴性对照)分别转染HPAECs后(分别为siNLRP3组、siNC组),再以10%CSE刺激12 h,应用annexin V/PI流式法检测这两组细胞在CSE刺激前后的凋亡水平。再将HPAECs分为对照(control)组、CSE组(加入10%CSE液)、NAC(乙酰半胱氨酸,N-acetylcysteine)+CSE组(以10 mmol/L NAC预处理1h后再以10%CSE培养液处理)及NAC组(以10 mmol/L NAC单独处理),均培养12 h后以DCFH-DA光探针标记法观察细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS),Western blot法测定NLRP3、caspase-1蛋白表达。结果siNC组在CSE刺激后,HPAECs存活率下降,凋亡率较CSE刺激前明显增加(P<0.05),SiNLRP3组在CSE刺激后,细胞凋亡率较siNC组同等CSE刺激后有所减少(P<0.05)。分组处理HPAECs后,CSE组细胞胞内ROS水平较对照组升高(P<0.05),NAC+CSE组细胞胞内ROS水平较CSE组有所下降(P<0.05)。CSE组NLRP3、caspase-1蛋白表达较对照组显著升高(P<0.05),而NAC+CSE组细胞NLRP3、caspase-1表达较CSE组下降(P<0.05)。结论CSE能诱导HPAECs发生凋亡及胞内ROS增加,伴有NLRP3炎性小体表达增加。NLRP3蛋白表达沉默能抑制CSE对HPAEC的促凋亡作用。