香石竹斑驳病毒属简并引物RT-PCR检测方法的建立

【目的】使用简并引物RT-PCR方法并结合序列测定与分析,为甲型香石竹斑驳病毒属(Alphacarmovirus)、乙型香石竹斑驳病毒属(Betacarmovirus)和丙型香石竹斑驳病毒属(Gammacarmovirus)病毒建立一种快速、灵敏、广谱的检测鉴定方法。【方法】通过基因组序列的多重比对分析,在依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)基因的保守区域设计1对简并引物Carmo-F2/Carmo-R2,在引物5′端分别加入非互补的富含AT序列(AATAAATCATAA)形成引物Carmo-F2a/Carmo-R2a,测试简并引物RT-PCR方法的广谱性、特异性和灵敏度,并对PCR产物进行测序、序列分析和系统发育分析。利用该方法对来自厦门的扶桑(Hibiscusrosa-sinensis)样品进行病毒检测。【结果】利用Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a两对引物建立的RT-PCR方法,扩增甲型、乙型和丙型香石竹斑驳病毒属病毒的部分RdRp基因,扩增片段分别约为500和550 bp。该方法成功用于检测甲型香石竹斑驳病毒属的香彩雀花碎色病毒(angelonia flower break virus,AnFBV)、小花矮牵牛斑驳病毒(calibrachoa mottle virus,CbMV)、香石竹斑驳病毒(carnation mottle virus,CarMV)、天竺葵花碎色病毒(pelargonium flower break virus,PFBV),乙型香石竹斑驳病毒属的木槿褪绿环斑病毒(hibiscus chlorotic ringspot virus,HCRSV),丙型香石竹斑驳病毒属的甜瓜坏死斑点病毒(melon necrotic spot virus,MNSV),显示出良好的广谱性。特异性检测表明,简并引物Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a在玉米褪绿斑驳病毒(maize chlorotic mottle virus,MCMV;Machlomovirus)、天竺葵线纹病毒(pelargonium line pattern virus,PLPV;Pelarspovirus)、香石竹环斑病毒(carnation ringspot virus,CRSV;Dianthovirus),健康的西瓜、甜瓜、南瓜、大豆、豌豆植物未扩增到预期大小的条带。灵敏度检测表明,简并引物Carmo-F2/Carmo-R2最低可检测到10-2稀释液,简并引物Carmo-F2a/Carmo-R2a可检测到10-3稀释液,在5′端加入非互补的富含AT序列可以提高简并引物RT-PCR检测方法的灵敏度。BLAST分析表明,测定的序列均与相应病毒种类具有最高序列一致性。部分RdRp基因氨基酸序列的系统发育分析结果符合目前通读病毒亚科(Procedovirinae)病毒的分类情况,且可以把病毒鉴定到种的水平。采集13份疑似病毒症状的扶桑样品,均检出木槿褪绿环斑病毒。【结论】基于简并引物Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a的RT-PCR方法,可用于甲型、乙型和丙型香石竹斑驳病毒属病毒的筛查检测,结合序列分析及系统发育分析可进行病毒种类的快速鉴定,并有助于发现新的病毒种类。厦门扶桑植物受到木槿褪绿环斑病毒的侵染。

昆明香石竹斑驳病毒鉴定

从表现为叶斑驳、花碎色症状的香石竹病株上获得一病毒分离物 ,经电镜负染观察 ,该病毒为直径是 2 8～ 33nm的球状粒子 ,病毒提取液经紫外光测定呈典型核蛋白吸收曲线 ,OD2 60 /OD2 80 =1 70 ;血清学反应与CarMV抗血清出现明显的沉淀线。由此 ,可基本认为该病毒分离物为香石竹斑驳病毒 (Carnationmottlevirus ,CarMV)。

福建省香石竹斑驳病毒的鉴定及其脱除

１９９５～１９９８ 年调查了福建省香石竹主要种植地的病毒病， 经症状观察、生物学鉴定、电镜观察和间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 法检测， 明确了香石竹斑驳病毒 （ Ｃａ Ｍ Ｖ） 是福建省田间流行的主要病毒种类， 带毒率为３０８％ ～７２４％ 。脱毒技术的研究结果表明， 热处理、茎尖培养脱毒效果均不够理想， 而茎尖培养加药物处理， 在培养基中加病毒必克２ ｍ ｌ· Ｌ－ １、５ ｍ ｌ· Ｌ－ １、１０ ｍ ｌ· Ｌ－ １， Ｃａ Ｍ Ｖ脱除率分别达 ３５７％ 、４６７％ 、６１５％ ； 低浓度 （２～５ ｍ ｌ· Ｌ－ １） 对茎尖生长有促进作用， 较高浓度 （＞ １０ ｍ ｌ· Ｌ－ １） 对植株生长有明显毒害作用。

香石竹斑驳病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清制备

香石竹斑驳病毒(Carnation mottle virus,CarMV)是侵染香石竹的主要病毒。本研究从已鉴定的CarMV毒源植物中提取总RNA,克隆外壳蛋白(cp)基因后构建pET30a-CP重组质粒,并转入BL21(DE3)pLysS进行原核表达。通过对诱导温度、初菌浓度、IPTG的浓度等表达条件进行优化,目的蛋白在37℃,IPTG终浓度为1.0 mmol/L的条件下,诱导表达6 h后获得最高表达量。采用割胶的方法纯化cp蛋白,纯化后的目的蛋白免疫小鼠获得了特异性抗血清。经Western-blot检测,结果表明所制备的抗血清与诱导表达的重组蛋白及接种CarMV的香石竹样品均发生特异性结合。利用所制备抗血清对昆明地区的48个香石竹样品进行抽检,结果表明香石竹样品的带毒率为79.2%。本研究为大规模抗血清生产、检测应用和深入研究该病毒cp基因与寄主的互作奠定基础。

昆明麝香石竹斑驳病毒分离物的鉴定与提纯及高效价抗血清的制备

对引起云南鲜切花麝香石竹植株叶斑驳、花朵变小的病毒分离物应用酶联免疫吸附测定(ELISA)和电子显微镜技术(IEM)检测,直径大约28nm,经TAS-ELISA测定仅与CarMV标准抗体反应为阳性。鉴定为麝香石竹斑驳病毒(Carnation mottle vi-rus,CarMV)的分离株。对病株检测筛选后进行分离纯化,将提纯后的CarMV制备兔抗血清获得高效价的抗体,间接ELISA测定为1∶10240。

香石竹斑驳病毒的初步研究 Ⅰ 病毒的生物学及病理学变化

香石竹斑驳病毒在供试的５科１３种植物中，能侵染３科５种植物，在苋色藜、昆诺阿藜、菠菜、千日红上产生枯斑，系统侵染中国石竹，中国石竹是最理想的繁殖寄主．该病毒的钝化温度为８０℃，稀释限点为１０－５～１０－６，体外存活期为６０ｄ．电镜观察纯化病毒是直径为２８ｎｍ的球状粒子，观察病叶超薄切片，可看到在木质部导管中存在呈晶状排列或散生的病毒粒子，在细胞质中病毒则排列在鞘状膜的结构中．

香石竹斑驳病毒(CarMV)的研究进展

香石竹斑驳病毒(CarMV)是侵染香石竹的主要病毒之一,严重影响香石竹切花产量与品质,影响其经济价值和进出口贸易。目前对香石竹斑驳病毒已有大量研究,为系统了解该病毒,笔者从CarMV的病原学、血清学和分子生物学,CarMV病害发生与检测及CarMV防治方法等方面综述了CarMV的研究现状。

香石竹斑驳病毒属和潜隐病毒属的PCR检测方法研究

根据香石竹斑驳病毒属和香石竹潜隐病毒属主要确定种的外壳蛋白(Coat protein,CP)氨基酸的保守序列分别设计出它们的简并引物,然后对8个香石竹斑驳病毒属的病毒和9个香石竹潜隐病毒属的病毒进行PCR检测验证,结果与预期值相符。

香石竹斑驳病毒(CarMV)脱除对几种生理指标的影响

感染病毒的香石竹组培苗于(38.5±1)℃条件下热处理29d后,切取0.1～0.2mm的茎尖生长点无菌培养成苗后,经DAS-Elisa检测获得脱除香石竹斑驳病毒(Carnation mottle virus,CarMV)的香石竹脱毒苗,取脱毒苗与非脱毒苗的叶片,测量叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素、丙二醛(MDA)、干物质含量几种生理生化指标。结果表明,脱毒苗与非脱毒苗相比:(1)叶绿素和类胡萝卜素含量增加,具有较强的光合效率;(2)与抗性生理有关的MDA含量下降,衰老减缓;(3)光合物质的形成与积累增多,干物质含量增加。

香石竹斑驳病毒(CarMV)主要基因的分子变异分析

香石竹斑驳病毒(Carnation mottle virus,CarMV)是侵染香石竹的主要病毒之一。本试验从12个香石竹品种中获得CarMV分离物,通过RT-PCR扩增包含p7、p9、CP 3个主要基因的片段,并对扩增产物进行克隆测序。通过序列比对发现CarMV的p7、p9、CP 3个基因有较高的稳定性,p7基因核苷酸序列相似性为98.10%,氨基酸序列相似性为97.81%,其中氨基酸的第11和14位存在显著差异;p9基因核苷酸序列的相似性为98.80%,氨基酸序列相似性为99.13%,氨基酸序列在第4位差异明显;CP基因核酸序列相似性为97.58%,氨基酸的相似性为98.43%,氨基酸序列的第164和331位的变异存在相关性,整个CP变异位点比较分散。证实p7和p9的变异位点主要集中在暴露与寄主互作相关的N端,推测这是导致病毒变异,与寄主互作变异的重要位点。

昆明地区香石竹病毒病流行状况调查及脱病毒苗的制备

对昆明地区 3种不同生产模式下的香石竹 (DianthuscaryophyllusL .)进行了调查 ,采集样本 146号 ,利用酶联免疫法和电镜检测法对样本感染香石竹病毒的情况进行检测。结果表明昆明地区主要流行的香石竹病毒为香石竹斑驳病毒和香石竹坏死斑点病毒。以带香石竹斑驳病毒的香石竹品种“俏新郎”为实验材料 ,研究了直接剥茎尖法、高温处理结合剥茎尖法和病毒痤处理结合剥茎尖法 3种方法在脱病毒效率和茎尖成苗率的差异。实验结果表明以加热处理结合剥茎尖法脱病毒效果最好 ,0 2mm茎尖脱病毒率可达 77 78% ,加 5 %病毒痤处理对脱病毒有一定的影响 ,直接剥茎尖法脱病毒效果最差。

组织直接印迹ELISA检测香石竹病毒

植物病毒的酶联免疫吸附分析检测技术（ELISA）的反应可以在硝酸纤维膜（NCM）上进行，称为dot－ELISA。为进一步简化实验步骤，改膜上点样为病组织直接印迹，以后则参照间接ELISA程序进行。成功地进行了香石竹斑驳病毒（CarMV）的快速检测，约比常规dot－ELISA缩短时间3h，灵敏度与聚乙烯板上的间接ELISA相似。讨论了使用辣根过氧化物酶标记抗体存在非特异性反应的可能性及克服办法。

课题研究

"主要园林植物保健型挥发性物质的测定"课题简介园林植物对环境与人类健康的影响除了通过其光合作用、呼吸作用、蒸腾作用外,还有植物挥发性物质的作用。如各类水果能释放出各自独特的香味;香樟的材质发挥出樟脑气味;松柏类树木具有特有的清香味;