香石竹斑驳病毒(CarMV)云南分离物CP基因的克隆和序列分析

香石竹斑驳病毒(CarMV)是侵染香石竹的主要病毒.关于该病毒的株系和不同地区分离物的病毒核酸序列研究报道较少.我们根据Guilley报道的该病毒的核酸序列设计引物,对香石竹斑驳病毒云南分离物的CP基因进行了RT-PCR扩增和序列分析.

香石竹斑驳病毒(CarMV)的研究进展

香石竹斑驳病毒(CarMV)是侵染香石竹的主要病毒之一,严重影响香石竹切花产量与品质,影响其经济价值和进出口贸易。目前对香石竹斑驳病毒已有大量研究,为系统了解该病毒,笔者从CarMV的病原学、血清学和分子生物学,CarMV病害发生与检测及CarMV防治方法等方面综述了CarMV的研究现状。

香石竹斑驳病毒属简并引物RT-PCR检测方法的建立

【目的】使用简并引物RT-PCR方法并结合序列测定与分析,为甲型香石竹斑驳病毒属(Alphacarmovirus)、乙型香石竹斑驳病毒属(Betacarmovirus)和丙型香石竹斑驳病毒属(Gammacarmovirus)病毒建立一种快速、灵敏、广谱的检测鉴定方法。【方法】通过基因组序列的多重比对分析,在依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)基因的保守区域设计1对简并引物Carmo-F2/Carmo-R2,在引物5′端分别加入非互补的富含AT序列(AATAAATCATAA)形成引物Carmo-F2a/Carmo-R2a,测试简并引物RT-PCR方法的广谱性、特异性和灵敏度,并对PCR产物进行测序、序列分析和系统发育分析。利用该方法对来自厦门的扶桑(Hibiscusrosa-sinensis)样品进行病毒检测。【结果】利用Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a两对引物建立的RT-PCR方法,扩增甲型、乙型和丙型香石竹斑驳病毒属病毒的部分RdRp基因,扩增片段分别约为500和550 bp。该方法成功用于检测甲型香石竹斑驳病毒属的香彩雀花碎色病毒(angelonia flower break virus,AnFBV)、小花矮牵牛斑驳病毒(calibrachoa mottle virus,CbMV)、香石竹斑驳病毒(carnation mottle virus,CarMV)、天竺葵花碎色病毒(pelargonium flower break virus,PFBV),乙型香石竹斑驳病毒属的木槿褪绿环斑病毒(hibiscus chlorotic ringspot virus,HCRSV),丙型香石竹斑驳病毒属的甜瓜坏死斑点病毒(melon necrotic spot virus,MNSV),显示出良好的广谱性。特异性检测表明,简并引物Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a在玉米褪绿斑驳病毒(maize chlorotic mottle virus,MCMV;Machlomovirus)、天竺葵线纹病毒(pelargonium line pattern virus,PLPV;Pelarspovirus)、香石竹环斑病毒(carnation ringspot virus,CRSV;Dianthovirus),健康的西瓜、甜瓜、南瓜、大豆、豌豆植物未扩增到预期大小的条带。灵敏度检测表明,简并引物Carmo-F2/Carmo-R2最低可检测到10-2稀释液,简并引物Carmo-F2a/Carmo-R2a可检测到10-3稀释液,在5′端加入非互补的富含AT序列可以提高简并引物RT-PCR检测方法的灵敏度。BLAST分析表明,测定的序列均与相应病毒种类具有最高序列一致性。部分RdRp基因氨基酸序列的系统发育分析结果符合目前通读病毒亚科(Procedovirinae)病毒的分类情况,且可以把病毒鉴定到种的水平。采集13份疑似病毒症状的扶桑样品,均检出木槿褪绿环斑病毒。【结论】基于简并引物Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a的RT-PCR方法,可用于甲型、乙型和丙型香石竹斑驳病毒属病毒的筛查检测,结合序列分析及系统发育分析可进行病毒种类的快速鉴定,并有助于发现新的病毒种类。厦门扶桑植物受到木槿褪绿环斑病毒的侵染。

我国发生的一种香石竹斑驳病毒株系的生物化学特性及互补DNA合成

以提纯的香石竹斑驳病毒BS株系为材料,抽提该病毒的RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果表明其RNA除有一个分子量约1.4×10~6道尔顿的主要组分外,还有一个分子量约0.55×10~6道尔顿的较弱组分。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测外壳蛋白亚基分子量约38 000道尔顿,由17种共335个氨基酸残基组成。以上述RNA为模板,3’末端加多聚腺苷酸尾序后,以Oligo(dT)_(15)为引物反转录合成双链cDNA,平末端插入载体质粒P^(EMBL)9。经抗生素及杂交选择,共获得27个阳性克隆。提取质粒后酶切鉴定,拼接,获得3.7kb近全长cDNA亚克隆P^(BSCY)35.^(32)P标记cDNA探针杂交检测,对香石竹斑驳病毒具特异性,灵敏度可达1ng RNA。部分cDN A序列测定证明,所得克隆包括全长外壳蛋白基因。

昆明香石竹斑驳病毒鉴定

从表现为叶斑驳、花碎色症状的香石竹病株上获得一病毒分离物 ,经电镜负染观察 ,该病毒为直径是 2 8～ 33nm的球状粒子 ,病毒提取液经紫外光测定呈典型核蛋白吸收曲线 ,OD2 60 /OD2 80 =1 70 ;血清学反应与CarMV抗血清出现明显的沉淀线。由此 ,可基本认为该病毒分离物为香石竹斑驳病毒 (Carnationmottlevirus ,CarMV)。

香石竹斑驳病毒三种脱毒方法比较

本文通过花瓣愈伤组织培养、胚珠培养以及茎尖培养与抗病毒化学药物——病毒唑处理相结合等3种方法,进行香石竹斑驳病毒的脱毒试验。用指示植物法、电子显微镜及酶联免疫吸附试验方法,对各种脱病毒处理后的试管苗进行严格的病毒检测。结果表明:(1)花瓣愈伤组织培养的脱毒率可达到78.26％;(2)胚珠培养法可以完全脱毒;(3)随着病毒唑处理时间的延长,茎尖培养的脱毒率增加,用病毒唑最佳浓度5 mg/L处理不同长度的茎尖,发现3mm以内者脱毒有效,1mm者脱毒率达80％。同时用显微免疫组织化学方法追踪检查病毒唑处理后病毒在茎夫区域的分布,发现病毒唑处理4周后,生长锥中已无病毒,仅小叶中含有病毒;5周后病毒完全脱去。讨论了香石竹3种脱病毒方法的应用以及病毒唑和组织培养相结合脱病毒的可能机理。

香石竹斑驳病毒单克隆抗体的制备及检测应用

用香石竹斑驳病毒(CarMV)免疫的BALB/c鼠脾细胞与Sp2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得5株能稳定传代且分泌抗CarMV单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞,并分别制备它们的单克隆抗体腹水。5株单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-6,其中3G1、1B9、2A9和2F8的抗体类型及亚类均为IgG1,而2F2为IgG3。W estern-b lot分析表明,5株单克隆抗体均与CarMV 38 kD的外壳蛋白亚基有特异性反应。利用2A9单抗建立的抗原包被的间接ELISA(ACP-ELISA)检测CarMV方法,病叶1∶800倍稀释、提纯CarMV病毒浓度为1 ng/mL(绝对检测量为0.1 ng)时仍能检测到病毒。利用ACP-ELISA对田间香石竹样品的检测表明,CarMV在香石竹上发病很普遍。

香石竹斑驳病毒的鉴定和RT-PCR检测

从表现为叶斑驳、花碎色症状的香石竹病株上获得一病毒分离物 ,电镜负染观察到直径为 2 8～ 33nm的球状粒子。病毒提取液经紫外光测定呈典型核蛋白吸收曲线 ,OD2 60 /OD2 80 =1 70 ;血清学反应与CarMV抗血清出现明显的沉淀线。通过以上实验结果 ,确定该病毒分离物为香石竹斑驳病毒 (carnationmottlevirus ,CarMV)。根据该病毒的RNA序列设计引物 ,对病健材料进行了RT PCR检测 ,结果从感病材料中扩增出大约 6 0 0bp的特异片段 ,而健康植物无此扩增带。将PCR产物连接 pGEM-T-easy载体 ,转化大肠杆菌JM 10 9,得到了含目的片段的重组子 ,经双脱氧序列分析 ,与Guilley报道的序列对应部分的核苷酸序列基本一致 (其同源性达 96 % ) ,最低检出病毒核酸含量为 5ng ,表明应用RT

福建省香石竹斑驳病毒的鉴定及其脱除

１９９５～１９９８ 年调查了福建省香石竹主要种植地的病毒病， 经症状观察、生物学鉴定、电镜观察和间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 法检测， 明确了香石竹斑驳病毒 （ Ｃａ Ｍ Ｖ） 是福建省田间流行的主要病毒种类， 带毒率为３０８％ ～７２４％ 。脱毒技术的研究结果表明， 热处理、茎尖培养脱毒效果均不够理想， 而茎尖培养加药物处理， 在培养基中加病毒必克２ ｍ ｌ· Ｌ－ １、５ ｍ ｌ· Ｌ－ １、１０ ｍ ｌ· Ｌ－ １， Ｃａ Ｍ Ｖ脱除率分别达 ３５７％ 、４６７％ 、６１５％ ； 低浓度 （２～５ ｍ ｌ· Ｌ－ １） 对茎尖生长有促进作用， 较高浓度 （＞ １０ ｍ ｌ· Ｌ－ １） 对植株生长有明显毒害作用。

香石竹斑驳病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清制备

香石竹斑驳病毒(Carnation mottle virus,CarMV)是侵染香石竹的主要病毒。本研究从已鉴定的CarMV毒源植物中提取总RNA,克隆外壳蛋白(cp)基因后构建pET30a-CP重组质粒,并转入BL21(DE3)pLysS进行原核表达。通过对诱导温度、初菌浓度、IPTG的浓度等表达条件进行优化,目的蛋白在37℃,IPTG终浓度为1.0 mmol/L的条件下,诱导表达6 h后获得最高表达量。采用割胶的方法纯化cp蛋白,纯化后的目的蛋白免疫小鼠获得了特异性抗血清。经Western-blot检测,结果表明所制备的抗血清与诱导表达的重组蛋白及接种CarMV的香石竹样品均发生特异性结合。利用所制备抗血清对昆明地区的48个香石竹样品进行抽检,结果表明香石竹样品的带毒率为79.2%。本研究为大规模抗血清生产、检测应用和深入研究该病毒cp基因与寄主的互作奠定基础。

昆明麝香石竹斑驳病毒分离物的鉴定与提纯及高效价抗血清的制备

对引起云南鲜切花麝香石竹植株叶斑驳、花朵变小的病毒分离物应用酶联免疫吸附测定(ELISA)和电子显微镜技术(IEM)检测,直径大约28nm,经TAS-ELISA测定仅与CarMV标准抗体反应为阳性。鉴定为麝香石竹斑驳病毒(Carnation mottle vi-rus,CarMV)的分离株。对病株检测筛选后进行分离纯化,将提纯后的CarMV制备兔抗血清获得高效价的抗体,间接ELISA测定为1∶10240。

香石竹脉斑驳病毒的研究——Ⅰ.病毒的生物学、病理学变化及血清学

香石竹脉斑驳病毒的寄主范围比较狭窄,只能侵染石竹科、藜科、苋科等几个科中的少数几种植物。昆诺藜和美国石竹是该病毒理想的鉴别寄主和繁殖寄主。病毒粒体为微弯曲的线条状,长790nm,宽12nm,能为国外提供的香石竹脉斑驳病毒抗血清均一包被。该病毒能被桃蚜以非持久性的方式传播,传播效率可达58%。本文还对病组织的超薄切片、病毒侵染组织中的双链RNA、病毒的体外抗性进行了研究。

香石竹斑驳病毒的初步研究 Ⅰ 病毒的生物学及病理学变化

香石竹斑驳病毒在供试的５科１３种植物中，能侵染３科５种植物，在苋色藜、昆诺阿藜、菠菜、千日红上产生枯斑，系统侵染中国石竹，中国石竹是最理想的繁殖寄主．该病毒的钝化温度为８０℃，稀释限点为１０－５～１０－６，体外存活期为６０ｄ．电镜观察纯化病毒是直径为２８ｎｍ的球状粒子，观察病叶超薄切片，可看到在木质部导管中存在呈晶状排列或散生的病毒粒子，在细胞质中病毒则排列在鞘状膜的结构中．

香石竹斑驳病毒检疫技术进展

自1955年发现香石竹斑驳病毒(Carnation mottle virus——CarMoV)以来,至今已有27个国家和地区报道这个病毒。由于它对香石竹的侵染率高,危害严重,引起各国高度重视,已有南非、意大利、马耳他、新西兰、东非等国家将这种病害列为禁止入境的检疫对象或列为限制进口对象。我国自1983年上海首次从荷兰引进香石竹幼苗中检出

聚乙二醇沉淀法部分提纯香石竹斑驳病毒

接种香石竹斑驳病毒四周后的高雪轮病叶用2倍体积磷酸缓冲液匀浆。滤液用氯仿和正丁醇澄清,二轮聚乙二醇(PEG)沉淀,得到具有侵染活性的部分提纯的香石竹斑驳病毒。提纯制剂的A260/280值为1.612,病毒含量5.9mg/ml。与等量福氏不完全佐剂乳化后,4次肌肉注射家兔,得到双扩散效价为1:2048的专化抗血清。结果表明,PEG沉淀结合高速离心,是部分提纯香石竹斑驳病毒的可行方法。

香石竹斑驳病毒鉴定与发生率初步分析

根据寄主范围与反应、粒体形态和血清学反应,香石竹病毒分离物“CV-1”被鉴定为香石竹斑驳病毒CaMV。该病毒在香石竹病毒病样中占有较高的比例。

上海地区香石竹斑驳病毒的若干行为

香石竹斑驳病毒(CaMV)是茎尖苗中的主要病毒,较难通过常规茎尖培养方法脱除。生物检测仍是剔除带毒苗的简易手段之一,高雪轮是CaMV的一种敏感检测寄主。上海地区CaMV不同分离物存在着寄主反应差异。不卫生园艺操作是CaMV田间扩散的重要因素。在国內普遍发现CaMV的情况下,香石竹外检对象钓拟定应进一步斟酌。香石竹脱毒方法也有待改进,以提高脱毒率。

香石竹脉斑驳病毒（CarVMV）鉴定和抗血清制备

将纯化鉴定后的香石竹脉斑驳病毒繁殖在美国石竹上，样品匀浆，澄清，两轮聚乙二醇沉淀后，硼酸缓冲液重新悬浮．即为粗提纯的病毒制剂。紫外光谱吸收测定，Ａ２６０～２９０／２８０为１．１２，制剂纯度７１％，病毒含量２．７５ｍｇ／ｍｌ。肌肉注射家兔得到微量沉淀效价１：１０２４的抗血清。这是国内首次制备出香石竹脉斑驳病毒抗血清。

昆明地区香石竹斑驳病毒的鉴定、提纯及抗血清制备

在昆明地区栽培的香石竹上发现了香石竹斑驳病毒，人工接种可局部侵染苋色藜、墙生藜、千日红及番杏，可系统侵染昆诺阿藜和美国石竹，分别造成褪绿斑、斑驳或坏死斑。经二轮ＰＥＧ（分子量６０００）沉淀，病毒提纯量约２２０ｍｇ／ｋｇ鲜组织。电镜观察病毒颗粒直径为２８ｎｍ，等轴对称。提纯物紫外扫描呈典型病毒核蛋白吸收峰，Ａ２６０／Ａ２８０值为１．５６。提纯病毒经４次免疫家兔，所得抗血清经试管沉淀测定效价为１∶４０９６，琼脂糖双扩散效价为１∶１０２４。