香菇C_(91-3)菌丝发酵液蛋白抑制小鼠宫颈癌细胞株U14生长及诱导凋亡的实验研究

目的研究香菇C91-3菌丝发酵液蛋白LFP91-3对小鼠腹水型宫颈癌细胞株(U14)的作用。方法应用不同剂量(50、100、150μg)的LFP91-3对U14所致小鼠腹水型宫颈癌模型进行治疗,观察荷瘤小鼠的生存期;并用MTT法LFP91-3浓度5、10、15μgml和流式细胞仪对经LFP91-3作用的U14进行观察和检测。结果LFP91-3能明显延长U14所致荷瘤小鼠的生存期。对体外培养的U14有直接杀伤作用,抑制率随LFP91-3浓度的增加和作用时间的延长而升高。流式细胞仪检测结果显示LFP91-3阻滞U14于细胞周期的分裂中期。结论LFP91-3能抑制小鼠宫颈癌细胞株的生长并诱导其凋亡。

香菇C91-3发酵液蛋白的初步分离及其体外抗肿瘤作用检测

目的探讨香菇C91-3发酵液蛋白(LFP91-3)的有效抗肿瘤成分及抗肿瘤作用。方法根据分子量对LFP91-3进行分组,分别测定各组的抗肿瘤活性,并检测效应组对细胞凋亡的影响。结果LFP91-3分为A、B、C三组,三组蛋白浓度分别为131.25、75.96、435.05mg/ml。各组均有抗肿瘤活性,C组活性最强,并可诱导H22细胞凋亡。结论LFP91-3在体外有良好的抗肿瘤作用。

香菇C_(91-3)转录本Unigene14872基因Pkinase结构域的克隆表达及其生物信息学分析

旨在克隆香菇C91-3转录本Unigene 14872基因中的Pkinase结构域,并对其进行生物信息学分析。提取香菇C91-3菌丝体中总RNA,根据转录组测序结果,用3'-Full RACE、5'-Full RACE方法获得Unigene 14872基因全长。用NCBI对其进行生物信息学分析,预测其具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Pkinase)结构域。设计引物PCR扩增Pkinase结构域,然后克隆至pET32a(+)载体,再热转化至JM109中保存并进行质粒测序。重组质粒pET32a(+)-Pkinase构建成功,并成功诱导表达重组蛋白,初步鉴定该蛋白具有抗肿瘤活性,为进一步研究重组蛋白的活性及作用机制奠定基础。

香菇C_(91-3)转录本Unigene 24277基因克隆表达及其生物学活性的研究

通过对香菇C91-3转录本Unigene 24277基因的生物信息学分析,克隆表达含RCC1结构域的Unigene24277基因,并研究其抗肿瘤活性。从香菇C91-3菌丝体中提取总RNA,反转录合成c DNA,并利用Rapid Amplification of c DNA Ends(RACE)技术获得基因全长。NCBI数据库分析提示其含有RCC1结构域。PCR扩增RCC1结构域,将其克隆产物与p ET-32a(+)载体连接,热转化至E.coil Rosetta-gami(DE3)中诱导表达,纯化、复性后,通过MTT法研究其抗肿瘤活性。结果显示原核表达载体构建成功,重组蛋白成功诱导表达,并初步证明了重组蛋白具有抑制肿瘤细胞增殖活性的功能,为后续抗肿瘤机制的探究奠定了基础。

香菇C91-3菌LP1蛋白在小鼠体内的抗肿瘤免疫作用

目的通过观察注射C91-3菌LP1蛋白对H22荷瘤小鼠的影响,探讨LP1蛋白在小鼠体内的抗肿瘤免疫作用。方法使用鼠肝癌H22细胞接种于BALB/C小鼠右腋下,建立小鼠H22实体瘤模型。取上述建立成功的H22实体瘤模型小鼠64只,体重20~25g;分为A、B两组,每组32只。A组再分为LP1实验Ⅰ组(300μg/只)、LP1实验Ⅱ组(100μg/只)、PBS对照组和顺铂对照组(4 mg/kg),每组8只,各组隔日给药1次,共给药5次。A组用于检测LP1蛋白作用后在小鼠体内对H22肿瘤的抑瘤作用、血清中IL-2含量以及脾中NK细胞活性等生理指标。B组按同样的方法分组,隔日给药1次,直至荷瘤小鼠死亡,记录各组小鼠的生存期,计算生命延长率。结果 LP1蛋白可以延长H22荷瘤小鼠的生存期,LP1实验组生存期达16.6d,较PBS对照组13.2d有明显提高。LP1蛋白在体内对H22实体瘤具有一定的抑制作用,对H22实体瘤进行病理切片、HE染色观察后发现,LP1实验组中H22肿瘤组织较PBS对照组肿瘤组织内出现炎性细胞浸润,局部可见坏死现象。使用ELISA法和LDH法分别检测H22荷瘤小鼠血清中IL-2含量以及NK细胞活性,发现LP1实验组IL-2水平和NK细胞活性较PBS对照组和顺铂对照组显著提高。结论 LP1蛋白可延长H22荷瘤小鼠的生存期限,提高小鼠的生存质量,具有一定的肿瘤抑制作用。其抑制作用主要是由增强H22荷瘤小鼠自身免疫力,提高NK细胞活性,发挥机体自身肿瘤免疫功能造成的。

香菇C_(91-3)菌丝发酵液提取蛋白抗小鼠宫颈癌U_(14)的初步探讨

目的探讨香菇C91-3菌丝发酵液提取蛋白对小鼠宫颈癌的作用。方法观察香菇C91-3菌丝发酵液提取蛋白对小鼠宫颈癌U14荷瘤小鼠生存期的影响和对体外培养的小鼠宫颈癌U14细胞的抑杀作用。结果香菇C91-3菌丝发酵液提取蛋白能明显延长小鼠宫颈癌U14荷瘤小鼠的生存期并能对体外培养的小鼠宫颈癌U14细胞有直接抑杀作用。结论香菇C91-3菌丝发酵液提取蛋白对机体有调节、增强机体免疫系统功能的作用。

香菇C_(91-3)转录组Unigene 28447基因的蛋白表达及其对细胞凋亡和周期的影响

目的克隆香菇C91-3转录组中Unigene 28447基因,对其进行生物信息学分析,并研究该基因结构域的生物学活性。方法提取香菇C91-3菌丝体中的总RNA,用3'-Full RACE、5'-Full RACE方法获得香菇菌丝体Unigene 28447基因全长;构建基因表达载体,进行原核诱导表达,将表达蛋白进行纯化、复性。运用MTT法、流式细胞仪法研究蛋白对肿瘤细胞生长、周期及凋亡的影响。结果成功构建重组质粒p ET32a(+)-Unigene,诱导重组蛋白表达,并进行纯化、复性。MTT法显示不同浓度蛋白对肿瘤细胞的生长抑制作用与对照组比较差异均有显著性意义(P<0.05),流式细胞仪显示此蛋白具有诱导肿瘤细胞改变周期和凋亡的作用(P<0.05)。结论初步鉴定Unigene 28447基因的结构域具有抗肿瘤活性。

香菇C_(91-3)菌凋亡相关基因24414功能域片段原核表达载体的构建

目的构建高效快速且方便的His-标签原核表达体系,对香菇C91-3凋亡相关基因24414功能域进行克隆。方法根据香菇C91-3凋亡相关基因24414的基因序列,分别设计特异性上下游引物,采用PCR方法,以24414基因序列为模板,扩增出24414基因的功能域序列。并将功能域基因连入pMD19-T Simple Vector克隆载体中,进行蓝白斑筛选,挑选出阳性菌落,提取质粒经双酶切及PCR验证后,进行基因测序。将克隆载体上目的基因连入pET-32a原核表达载体,构建重组质粒。转化入E.coli JM109宿主菌,经双酶切验证后,进一步测序鉴定验证重组质粒。结果 PCR扩增出大小为747 bp的基因片段,测序结果显示与香菇C91-3凋亡相关基因24414的功能域片段同源性为100%,并成功构建了原核表达体系。结论重组原核表达载体pET-32a-24414的成功构建为进一步研究香菇C91-3凋亡相关基因24414功能域的表达纯化及生物学活性奠定了基础。

香菇转录本Unigene 10627过氧化物酶结构域的克隆表达及抗氧化活性研究

目的分析香菇C91-3转录本Unigene 10627基因的结构域,并对其进行诱导表达,初步探讨所得目的蛋白的抗氧化活性。方法将香菇C91-3菌丝体中总RNA提取出来,通过反转录获得cDNA文库,根据反转录结果,通过3′-RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends),5′-RACE技术扩增获取基因全长。通过生物信息学方法预测基因的结构域,利用PCR技术扩增该目的片段,将扩增产物连接到原核表达载体pET32a(+)上,采用热转化法转至E.coli Rosetta-gami(DE3)中进行诱导表达,对目的蛋白进行分离、纯化及鉴定。采用二苯代苦味酰自由基(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)法检测蛋白的抗氧化活性。结果成功获得基因全长,预测结果表明该基因具有染料脱色过氧化物酶结构域(DyP_Perox),双酶切结果证实目的片段成功插入,并通过诱导表达获得目的蛋白。结论目的蛋白成功表达,且具有抗氧化活性,为进一步研究其生物学活性提供基础。