尖孢镰刀菌西瓜专化型RPA检测方法的建立与评价

[目的]构建了西瓜枯萎病菌——尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum,FON)的重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)的快速检测体系,以期为田间西瓜枯萎病的快速检测提供技术支持。[方法]从NCBI网站下载包括西瓜枯萎病菌在内的11种病原真菌的基因组序列,利用SeqHunter 2软件进行生物信息学分析,经比对得到4个FON的特异性基因片段,并对其进行引物设计和筛选。利用聚合酶链式反应(PCR)验证引物的特异性和灵敏度,然后利用建立的RPA检测体系对引物的特异性和灵敏度进行验证,最后进行人工接种FON的西瓜植株的RPA检测与评价。[结果]建立了FON的RPA检测体系,并对DNA恒温快速扩增试剂盒的扩增体系进行最佳反应时间(40 min)和最适反应温度(30℃)的摸索,得到其最佳反应体系的检测下限为100 pg·μL^(-1)。利用DNA恒温快速扩增试剂盒(胶体金试纸条型)进行扩增时,只需在38℃反应12 min,取50μL稀释20倍的扩增产物用胶体金试纸条进行检测,5 min后即可进行结果的判断,检测下限为100 pg·μL^(-1)。[结论]成功构建FON的RPA检测体系,且建立的RPA检测体系能够从温室接种FON之后未显症的西瓜植物组织基因组DNA中检测到FON,可为田间西瓜枯萎病早期的快速检测提供技术支持。

尖孢镰刀菌亚麻专化型Folcdc15基因参与调控分生孢子发生和菌丝生长

通过对尖孢镰刀菌亚麻专化型Folcdc15基因敲除及敲除突变体互补试验,探究该基因在尖孢镰刀菌亚麻专化型中的功能。对Folcdc15基因进行DNA测序后,使用Split-Marker技术,构建含有潮霉素抗性基因(hph)缺失盒。通过PEG介导法转入野生型原生质体,在含有潮霉素的选择培养基上进行转化子筛选,通过PCR正负筛选确定敲除突变体。利用pZWH1载体构建含有Folcdc15的互补载体pZLY1,将其转入敲除突变体中进行互补测验。与野生型hm相比,敲除突变体ko1菌落生长速率下降了73%,菌丝形态发生了显著改变,菌丝变短且分叉变多,分生孢子隔膜数量增多长度增加,分生孢子数量显著减少。亚麻侵染试验表明,ko1的致病力显著降低。通过互补测验发现,回复突变株ca1恢复了Folcdc15基因缺失带来的分生孢子产量及形态、菌落生长和形态及致病力的缺陷。Folcdc15参与调控尖孢镰刀菌亚麻专化型的分生孢子发生及菌丝生长。

尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种红色荧光蛋白基因转化

采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化体系,成功地将红色荧光蛋白基因DsRed转入到尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种B2菌株中。在显微镜下观察连续转接6代的转化子,结果都可以观察到很强的红色荧光,表明DsRed基因在转化的B2菌株中能稳定遗传。通过PCR验证,也表明红色荧光蛋白基因DsRed已经转入到尖孢镰刀菌中。对香蕉的致病力测定结果表明,转化子与野生型菌株B2相比没有明显差异。

尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种fpd1基因敲除与表型分析

为了研究尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种fpd1基因的功能,构建了该基因敲除突变体并对其表型特征进行了分析。结果表明,与野生型菌株相比,fpd1基因敲除突变体生长减慢,产孢量显著降低,对巴西蕉的致病性明显减弱;fpd1基因可能在尖孢镰刀菌古巴专化型的产孢、生长发育和致病性等方面具有重要作用。本研究结果为进一步研究fpd1基因的功能和尖孢镰刀菌的致病机理奠定了基础。

尖孢镰刀菌古巴专化型fgb1基因敲除突变体的构建与表型分析

为了研究尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白β亚基编码基因fgb1的功能,构建fgb1基因敲除突变体,分析fgb1敲除突变体的表型。结果表明:敲除fgb1基因导致突变体菌落在PDA培养基上生长减慢,产孢量和菌丝分枝减少;致病性测定结果表明fgb1基因敲除突变体对巴西蕉的致病性减弱;用激光共聚焦显微镜观察感病香蕉根系,发现fgb1基因敲除突变体仍可在根系维管束中定殖。本研究结果为进一步研究G蛋白信号传导途径在尖孢镰刀菌古巴专化型中的作用奠定了基础。

尖孢镰刀菌古巴专化型SIX7基因分析

SIX蛋白编码基因最早由尖孢镰刀菌番茄专化型入侵的番茄木质部蛋白质组中发现,且成功用于区分尖孢镰刀菌番茄专化型的3个生理小种。一些SIX编码基因亦在引起香蕉枯萎病的Fusarium.oxysporum f.sp.cubense(简称Foc)中有报道,为区分Foc不同生理小种或亚型,比较分析了Foc中的SIX7基因序列及其特异性。以现有的SIX7基因序列设计合成引物,通过PCR扩增并测序,比较分析国内不同地理区域及来源于澳大利亚与南非的Foc1、Foc2、Foc3、Foc4共56株菌株中的SIX7基因,并以8个以上其他专化型或其他种或属病原菌共39株菌株分析了SIX7基因序列的特异性。研究发现所设计合成的SIX7基因引物序列仅能从供试的亚热带4号生理小种(ST4)中扩增出663 bp的目的条带。亚热带4号生理小种(ST4)中仅有的SIX7基因序列结合Foc4特异性引物Foc-1/Foc-2可快速区分Foc4亚型,提供了快速区分香蕉枯萎病病样内的Foc4亚型的分子鉴定手段,可指导蕉农及时采取有效防控香蕉枯萎病的措施。

尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的磷酸化应激诱导蛋白1(FoSTIP1)基因的克隆及表达分析

本研究克隆了尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Fusariumoxysporumf.sp.cubenserace4,Foc4)转录因子FoS kn7一个候选的下游基因,结果表明该基因cDNA编码序列全长1737 nt,编码一个含578个氨基酸残基的蛋白质。对其编码的蛋白进行了结构域和进化分析,结果表明该蛋白质含有胁迫诱导蛋白(stress-in-ducible protein-1, STI1)结构域和多个三角形4肽重复序列结构域(tetratricopeptiderepeat,TPR)。该蛋白质与尖孢镰刀菌番茄专化型的磷酸化应激诱导蛋白1(STIP1)亲缘关系最近,因此初步将其确定为Foc4的磷酸化应激诱导蛋白并命名为FoS TIP1。采用相对荧光定量PCR方法分析了该基因在野生型B2菌株入侵香蕉苗根部及在外源H_2O_2诱导情况下的表达变化,也分析了FoSKN7基因缺失突变体中该基因在外源H_2O_2诱导情况下的表达。结果表明在入侵香蕉苗根部及在外源H_2O_2诱导情况下,B2菌株中的FoSTIP1表达均有上调,而FoSKN7基因缺失突变体中FoSTIP1即使有H_2O_2诱导,其表达也远低于B2菌株中的FoSTIP1。推测FoSTIP1可能是FoS kn7的靶基因并参与了Foc4抗外源氧化胁迫。

香蕉枯萎镰刀菌4号生理小种FoSP1基因功能的初步分析

香蕉枯萎病是我国香蕉生产中危害最大,且难以防治的一种真菌病害。由于香蕉枯萎病的影响,我国近年来香蕉种植面积逐年减少,给我国亚热带、热带香蕉产业带来了巨大的经济损失。该病害是由于香蕉的维管束受到病原菌尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)入侵而发生,其繁殖速度快,引起香蕉叶片黄化和植株萎蔫。通过比较Foc1号生理小种(Foc1)N2菌株和4号生理小种(Foc4)B2菌株的基因组及转录组序列,筛选出位于基因组特异区间并且表达量较高的分泌蛋白FoSP1。结果表明:FoSP1基因开放阅读框为387 bp,编码129个氨基酸,其信号肽切割位点位于第20~21位氨基酸残基之间,且该蛋白无任何已知的结构域和功能位点,因此推断出FoSP1是一个新的分泌蛋白。为了研究该蛋白在Foc4菌株中的生物学作用,本研究利用split-marker的方法敲除了B2菌株的FoSP1基因,并对获得的正确敲除突变体进行表型分析和致病性测定。结果表明:相比野生型B2菌株,FoSP1基因敲除突变体菌丝的营养生长无显著差异,对NaCl、山梨醇和H_(2)O_(2)等外源胁迫均表现不敏感,但敲除突变体的产孢量和分生孢子萌发率显著降低,且对巴西蕉苗的致病力明显减弱。由此推测分泌蛋白FoSP1不参与Foc4菌株B2的营养生长,但在其产孢及致病的过程中发挥着重要作用。此结果为进一步研究Foc4基因组特异区间分泌蛋白的致病机制奠定基础。

尖孢镰刀菌亚麻专化型生物学特性研究

文章旨在研究尖孢镰刀菌亚麻专化型病原体的生物学特性。探索温度、pH、光照、培养基、碳源及氮源等条件对该病原体菌丝生长、分生孢子产生和萌发的影响。结果表明,该菌菌丝分别在30℃、pH 7、8条件下生长最快;持续黑暗及PDA培养基上生长状况最好;可有效利用多种碳、氮源,其中以淀粉、氯化铵最适。分生孢子的产量及萌发率分别在25、30℃,pH 7、8条件下最高;光照亦利于孢子的产生和萌发;PSA培养基适于产孢,PDA培养基适于孢子萌发;所试条件的产孢及孢子萌发最适碳源分别为乳糖、果糖,氮源为氯化铵及L-半胱氨酸。系统掌握了该病原体的生物学特性,为亚麻田间病害防治提供了理论依据。

茄科尖孢镰刀菌3个专化型细胞壁降解酶的比较

对茄科作物致病尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,FOL)、茄子专化型(F.oxysproum f. sp. melongenae,FOM)和辣椒专化型(F.oxysporum f. sp. capsicum,FOC)细胞壁降解酶多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)、果胶甲基反式消除酶(PMTE)及纤维素酶(Cx)进行比较。对3个专化型分别在寄主植物体内细胞壁降解酶活性测定表明:发病茄子和番茄体内酶活性从高到低依次为PG、PMG、PGTE、Cx 和PMTE,发病辣椒体内酶活性从高到低依次为PG、PGTE、PMG、PMTE 和Cx。体外诱导试验发现,FOC所产生的PG活性比FOM和FOL高,而FOM所产生的PGTE比FOC和FOL高,3个专化型的PMG、PMTE和Cx活性没有显著差异。通过PG同工酶薄层等电聚焦电泳分析,FOL、FOM和FOC分别产生5、5、3个PG同工酶,各有1条特异的PG同工酶条带。推测此3个专化型PG同工酶的差异可能和病原菌的致病作用和寄主专化性差异有关。

西瓜专化型尖孢镰刀菌FonSIX6缺失突变体的构建

病原菌和植物相互作用时分泌效应蛋白(effectors)抑制植物的防卫反应。枯萎病是由尖孢镰刀菌引起的真菌病害,尖孢镰刀菌和寄主相互作用时分泌几个特定的富含半胱氨酸的小分子量蛋白(15.8～29.9kD)进入木质部启动致病力,称为SIX(secreted in xylem)蛋白,其中,SIX6蛋白是一个效应蛋白。西瓜枯萎病是由西瓜专化型尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.Niveurn,Fon)引起的真菌病害。为了明确FonSIX6在侵染西瓜时的作用,克隆了该基因的上下游序列,以潮霉素为筛选标记构建了该基因的缺失突变体载体pDH-SIX6;将构建好的基因缺失载体转入农杆菌AGL-1中,通过农杆菌介导的遗传转化和转化子的筛选获得了FonSIX6基因的缺失突变体。

香蕉枯萎病菌候选效应蛋白FoSSP20的鉴定和功能初探

为了鉴定课题组前期在Foc4基因组中筛选的候选效应蛋白的毒力功能,以从中选取的FoSSP20为研究对象,通过生物信息学分析其结构,并通过信号肽分泌实验、亚细胞定位实验、烟草瞬时表达实验和qRT-PCR初步分析其功能,结果显示,利用酵母分泌实验验证FoSSP20的信号肽的分泌功能,亚细胞定位分析表明分泌蛋白定位于烟草(Nicotiana benthamiana)细胞的细胞膜和细胞核中。qRT-PCR结果分析表明FoSSP20在香蕉枯萎病菌侵染前期显著上调表达。以上结果表明,FoSSP20是一个经典分泌蛋白,可能在病原菌侵染过程中发挥作用。

香蕉枯萎和细菌性软腐病菌的多重PCR检测

香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense和细菌性软腐病菌Dickeya zeae的复合侵染为害给香蕉产业发展带来严重挑战,有必要建立相关病害的多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction, multiplex PCR)检测技术。本文基于尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种(F.oxysporum f.sp.cubense race 1,FOC1)基因组contig 438区间(35 631-37 693 bp)(GenBank:AMGP01000438.1)和4号生理小种(F.oxysporum f.sp.cubense race 4,FOC4)基因组contig 195区间(4 028-6 126 bp)(GenBank:AMGQ01000195.1)存在160 bp插入序列差异设计特异扩增引物FOC-F/-R,同时以香蕉细菌性软腐病菌D.zeae的促旋酶B亚单位基因(the subunit B of gyrase gene)(GenBank:JQ284039)序列设计特异扩增引物gyrB-F/-R。多重PCR检测结果显示:本技术可在一次PCR扩增反应内同时检测香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种和细菌性软腐病菌;多重PCR的灵敏度结果表明:检测香蕉枯萎病菌的DNA浓度最低限为0.1 ng/μL,细菌性软腐病菌的灵敏度为103cfu/mL;检测结果稳定可靠。因此,本研究建立的多重PCR检测方法可有效应用于检测香蕉发病组织中的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌,也可用于香蕉种苗和田间土壤带病菌的监测,为香蕉种植保驾护航。

尖孢镰刀菌黄瓜专化型生物学特性研究

以黄瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporium f.sp.cucumerinum,FOC)为试材,采用菌丝生长速率和血球计数法,研究了不同温度、pH、光照、培养基、碳源、氮源和微量元素对其菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响,明确尖孢镰刀菌黄瓜专化型的最适生长条件,以期为黄瓜枯萎病的田间防治提供参考依据。结果表明:该病原菌适宜生长的温度范围为20～30℃,最适温度为25℃;最适pH为6.0～9.0,且pH在7.0～9.0范围内孢子萌发率较高;光照交替和黑暗条件更有利于FOC菌丝生长、产孢和孢子萌发;病原菌在PDA、PSA培养基上生长速率较快,产孢量和孢子萌发率均较高,其次是PMA、燕麦片培养基;在含有葡萄糖、麦芽糖和蛋白胨、硝酸钾、硝酸钠以及硫酸亚铁的培养基上FOC生长速率、产孢量和孢子萌发率均最佳。

尖孢镰刀菌冬瓜专化型鉴定初报

尖孢镰刀菌冬瓜专化型鉴定初报孙妍芳，李爱华（西安市农业科学研究所西安７１００５４）（西安市植保站西安７１００５４）枯萎病是瓜类作物的主要病害，其病原菌划分为不同的专化型。目前已鉴定并命名的专化型有西瓜专化型（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｓｃｈｌ...

香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种在‘巴西蕉’植株及根际土壤中的时空分布

【目的】香蕉Musa spp.是我国重要的经济作物之一,由尖孢镰刀菌古巴专化型Fusarium oxysporum f.sp.cubense(Foc)引起的香蕉枯萎病蔓延快、根治难,严重阻碍了我国香蕉产业发展。由于Foc菌量和空间分布与其侵染和致病作用直接相关,探索Foc在‘巴西蕉’Musa acuminate L.AAA group,cv.Brazilian植株和土壤中的时空分布具有重要意义。【方法】采用伤根接种法对‘巴西蕉’苗分别接种香蕉枯萎病菌1号生理小种(Foc1)和4号生理小种(Foc4),通过实时荧光定量PCR技术检测接种后不同时间、不同香蕉组织及根际土壤中的菌量,分析了香蕉枯萎病菌在植株和土壤中的时空分布。【结果】温室中接种Foc后2~21 d内,‘巴西蕉’根部和球茎中Foc1和Foc4菌量随时间延长而逐渐增加,但Foc4菌量始终大于Foc1;在‘巴西蕉’球茎中,Foc1和Foc4分别在接种后21和14 d菌量达到最大。田间接种Foc后30 d,离‘巴西蕉’植株地面半径(r)5 cm、地下深度25~30 cm土壤中的Foc1和Foc4菌量最大;而r为15和30 cm时,地下深度10~15 cm土壤中的Foc菌量大于0~5和25~30 cm的菌量;在相同r和地下深度的‘巴西蕉’根际土壤中,一般Foc4菌量大于Foc1。【结论】Foc1和Foc4菌量在‘巴西蕉’植株和根际土壤中具有明显不同的时空分布,同一空间中Foc4菌量大于Foc1菌量,研究结果可为香蕉枯萎病的发生流行、预测预报和防控提供一定的理论指导。

尖孢镰刀菌古巴专化型FocGSNOR基因功能初步分析

在尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种基因组中鉴定到一个编码S-亚硝基谷胱甘肽还原酶的基因FocGSNOR。为了探索FocGSNOR在尖孢镰刀菌生长和对寄主致病力中的作用,本研究首先构建了该蛋白编码基因的敲除突变体菌株,并进一步对其生长和致病等表型进行了分析。结果发现,FocGSNOR基因的敲除明显抑制了尖孢镰刀菌的营养生长、产孢及其对寄主香蕉植株的致病力。另外,与野生型菌株WT相比,敲除突变株ΔFocGSNOR对抑菌药物异菌脲、三唑酮和过氧化氢的抗性有明显差异。以上结果表明FocGSNOR是尖孢镰刀菌重要的致病因子。

厄瓜多尔:引进抗枯萎病香蕉新品种

厄瓜多尔将采收第二种抗香蕉枯萎病的香蕉品种——以色列的GAL品种。香蕉枯萎病病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种热带型。GAL品种是该国进口的第二种对抗香蕉枯萎病的香蕉品种,第一种是2022年4月引进的新北蕉品种(Formosana 218)。

拮抗香蕉枯萎病镰刀菌木霉菌株的分离筛选

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型引起的,目前尚缺乏有效的防治方法,木霉菌是重要的植物病害防治菌,广泛分布于自然界。木霉菌具有广泛的适应性,能杀伤多种重要的植物病原菌且作用机制多种多样。笔者从广东湛江、海南儋州等地152份土样中分离出330株木霉,通过对峙法对木霉菌进行体外拮抗作用测定及评价,选出10株对尖孢镰刀菌有较好拮抗效果的木霉菌;并测定无菌土中木霉与病原菌的种群动态变化,结果表明木霉在土壤中对病原菌有一定的抑制作用。

太空香蕉‘天成1号’枯萎病菌的分离鉴定

‘天成1号’香蕉Musa×paradisiaca‘Tiancheng No.1’是利用‘巴西蕉’通过航天育种选育的香蕉新品种,在区域种植试验中出现植株枯萎症状。取其枯萎病植株组织,经分离、纯化、培养病原菌,并将病原菌灌根回接蕉苗进行致病性测定,同时结合形态学特征和rDNA-ITS序列检测的方法鉴定病原菌类型。根据形态特征鉴定‘天成1号’枯萎病病原菌株LWZ-XJ-4为尖孢镰刀菌,基于r DNA-ITS序列构建的系统发育树显示该病原菌与尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种进化距离最近。研究结果明确了引起太空香蕉‘天成1号’枯萎病的病原菌类型,对该香蕉品种枯萎病防控及推广种植有重要意义。