香蕉枯萎病菌1号小种分泌蛋白与效应子的预测与分析

由尖孢镰刀菌古巴专化型1号小种(Fusarium oxysporum f. sp.cubense race 1,Foc1)引起的香蕉枯萎病是香蕉生产上的毁灭性病害之一。分泌蛋白作为一类重要致病因子,在Foc1与香蕉互作过程中起着重要作用。本文利用SignalP、WoLF PSORT、TargetP、TMHMM和big-PI Predictor等生物信息学软件,对Foc1全基因组编码的15 438条蛋白质氨基酸序列进行了分泌蛋白及效应子的预测分析。结果表明,Foc1全基因组编码蛋白中有988个经典分泌蛋白,占编码蛋白总数的6.40%。蛋白特征分析表明,其氨基酸长度主要集中在101~500个氨基酸(占总数的71.26%),信号肽长度集中在17~20个氨基酸(占61.94%),信号肽切割位点以SPaseⅠ型为主(占92.91%)。碳水化合物酶类(CAZymes)分析表明,有281个分泌蛋白属于CAZymes,其中以糖苷水解酶家族最多。对细胞壁降解酶类分析表明,有27个分泌蛋白属于纤维素降解酶类,73个属于果胶降解酶类,42个属于木聚糖降解酶类。以氨基酸长度≤400和半胱氨酸残基数≥4为筛选条件,发现Foc1经典分泌蛋白中有378个候选效应子。qRT-PCR分析表明,7个候选效应子均在香蕉组织提取物诱导后获得上调表达,从实验角度证实了其为真正的效应子。

香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的快速检测与鉴定

【目的】从香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种特有的基因序列入手,建立一种快速可靠的分子检测技术,为防止香蕉枯萎病的传播蔓延、尽早采取防治对策、指导香蕉生产进行品种配置提供理论依据。【方法】根据研究室已经筛选到的4号生理小种候选致病相关基因序列设计引物,分别以来自海南、广东和广西的6个香蕉枯萎病菌1号生理小种菌株、7个4号生理小种菌株、7个尖镰孢其它专化型菌株以及2个外围菌株DNA为模板进行PCR扩增,筛选香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种特异性引物及尖镰孢菌的通用引物。【结果】筛选到的特异性引物不仅可用于香蕉枯萎病菌DNA的检测,还可直接用于对罹病香蕉组织和土壤中的香蕉枯萎病菌的检测;筛选到的尖镰孢菌通用引物,可作为内参照以检测DNA的质量,以避免假阴性情况的出现。【结论】所建立的三重PCR检测方法实现了在一次PCR反应中快速、准确地同步检测香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种,对检测香蕉苗是否感染枯萎病及蕉园土壤是否受到香蕉枯萎病菌的污染具有重要意义。

香蕉枯萎病菌4号生理小种致病相关基因foABC1的分离

通过对香蕉枯萎病菌4号小种致病突变体B1233的进一步研究,分离了被突变的致病相关基因foABC1,同源性分析及保守结构预测该基因编码一类ABC转运蛋白,其功能可能同稻瘟病菌的ABC转运蛋白一样,负责真菌毒素的泵出,或是像其他真菌的ABC转运蛋白,在病原菌侵染寄主植物时能忍耐植物因防卫反应所释放的植保素或抗毒素类物质。

香蕉枯萎病菌1号生理小种遗传转化体系的建立

利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化方法,建立香蕉枯萎病菌1号生理小种(Fusariumoxysporum f.sp cubense race 1)遗传转化体系,并对影响转化效率的因子进行优化,明确了高效转化的条件为:农杆菌OD600为0.15,AS诱导浓度为150μmol/L,诱导时间为7 h,Focr1-N2孢子浓度为1×106个/mL,潮霉素B筛选的浓度为150μg/mL,诱导培养基pH值为5.5,共培养温度为25℃,共培养时间为48 h为最佳条件。构建了包含1 200个突变体的突变体库,并对1 200个突变体进行了致病性测定,初步筛选出致病性丧失突变体20个,致病性显著减弱突变体18个,致病性严重增强突变体53个。

香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种内切多聚半乳糖醛酸酶基因的比较

通过基因克隆和测序方法,对来自国内外尖孢镰刀菌古巴专化型Fusarium oxysporum f. sp.cubense(简称Foc) 1号和4号小种的6个菌株endo-PG基因同源性、与其他真菌的亲缘关系以及endo-PG基因和氨基酸序列进行分析,为香蕉枯萎病菌致病机制的研究奠定基础。结果表明,同小种的endo-PG序列同源性高,亲缘关系近,不同小种的同源性较低,亲缘关系较远;总体来说,4号小种比1号小种同源性更高,亲缘关系更近。在全基因序列分析中,没有发现明显的基因差异可以作为区分2个小种致病性差异的依据。根据预测的CDS序列翻译成氨基酸序列比对,发现6个菌株的endo-PG基因编码的氨基酸变异并没有引起相关保守结构域的变化,推测6个菌株的致病性可能与endo-PG基因的调控相关。

香蕉枯萎病菌4号生理小种β1-微管蛋白基因的功能分析

本研究克隆并鉴定香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)β1-微管蛋白(β1-tub)基因,采用Split-marker同源重组技术获得Foc4的β1-tub基因敲除突变体,通过测定突变体菌株的生长速度、产孢量、致病力及对多菌灵敏感性,研究β1-tub基因在香蕉枯萎病菌的生长发育及对多菌灵抗药性中的作用。结果表明:与Foc4野生型菌株相比,敲除突变体生长缓慢、菌丝畸形及产孢量增加,对巴西蕉苗的致病力明显减弱,但对多菌灵的抗性水平无明显变化。由此推测β1-tub基因可能在Foc4的生长发育、产孢及致病力等方面具有重要的作用。

香蕉枯萎病菌4号生理小种smy1基因的功能分析

Smy1是一种参与调控真菌生长的驱动蛋白。本研究克隆了香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc 4)驱动蛋白基因smy1,并采用同源重组技术获得smy1敲除的野生型Foc 4的smy1敲除突变体。通过测定突变体菌丝形态、生长速度、产生孢子量、对香蕉苗的致病力及对氰烯菌酯的敏感性,用于研究smy1在香蕉枯萎病菌的生长发育及对氰烯菌酯抗药性中的作用。结果表明,与野生型Foc 4相比,smy1敲除突变体生长缓慢、菌丝畸形、产孢量增加,对巴西蕉苗的致病力减弱,但对氰烯菌酯的抗性水平变化不大。由此推断smy1基因可能在Foc 4的生长发育、产孢以及致病力等方面具有重要作用。

海南省香蕉枯萎病病原菌的分离鉴定及1号、4号小种的生物学特性

香蕉枯萎病是目前国内和世界很多地区香蕉种植区的一种毁灭性病害,目前尚未找到有效的防治方法。本文采集了海南省不同地区香蕉枯萎病的病原菌,通过经典病理学与分子生物学的方法进行了鉴定,此外还优化了快速检测的方法。结果表明,通过接种巴西香蕉和粉蕉进行致病性检测以及分离菌rDNA-ITS测序结果,明确鉴定出供试的香蕉分离菌株为4号生理小种,粉蕉分离菌株为1号生理小种。为了对1号、4号生理小种有更多的了解,本文还对1号、4号小种菌株生物学特性进行了测定,确定了影响菌丝生长的最佳条件。结果显示,pH5时最适合1号、4号生理小种的菌丝生长,适合菌丝生长的温度为19～28℃之间,温度达到37℃时菌丝不能生长,碳源对菌丝的生长影响不大。这些方法和数据可以有利于田间香蕉枯萎病病害的检测和最终确定,生物学特性的测定可以为耕作技术的改进和农药的研发提供参考依据。

农杆菌介导的香蕉枯萎病菌4号生理小种转化体系的优化

香蕉枯萎病是世界范围内香蕉种植区最为严重的病害之一,严重威胁和影响着香蕉产业的发展。本文针对香蕉枯萎病病原菌的4号生理小种,建立了农杆菌介导的转化体系,确定了影响转化效率主要因子的优化体系是:农杆菌在IM培养基诱导前农杆菌OD600为0.15、农杆菌经IM液体培养基诱导的时间为7h、乙酰丁香酮(AS)浓度为150μmol/L、Focr4孢子浓度为1×106个/mL、共培养时间为48h、培养温度为25℃、诱导培养基pH值为5.5。在此条件下,转化效率能达到700～800个转化子/106个香蕉枯萎病菌孢子。PCR验证表明外源的T-DNA已经成功随机地整合到该病原菌基因组中。目前,应用该转化体系已获得2300多个转化子,为后续克隆相关致病基因打下了良好基础。

香蕉枯萎病菌4号生理小种农杆菌介导遗传转化体系的建立及T-DNA插入突变体的筛选

【目的】通过农杆菌介导的遗传转化（ATMT）方法，建立香蕉枯萎病4号生理小种的高效转化体系，构建病原菌的突变体库并进行筛选，为已突变基因提供分子标记，在分子水平上对香蕉枯萎病菌的功能基因进行深入研究。【方法】通过单因子变量（试验材料、真菌孢子浓度、农杆菌预诱导终浓度、IM诱导培养基pH、共培养介质、共培养时AS浓度、共培养温度）试验，研究影响农杆菌介导的遗传转化效率的关键因素，并通过形态观察与致病性试验筛选突变体。【结果】得到的最佳转化条件为：农杆菌预诱导浓度OD600=0.8，病原菌孢子浓度106 CFU/mL，转化受体材料为分生孢子，共培养培养基pH 5.4，共培养温度25 ℃，共培养培养基中AS浓度200 μmol/L，共培养介质为硝酸纤维素膜。通过条件优化，转化效率可达到800-900个转化子/106个孢子。【结论】通过农杆菌介导的遗传转化成功将GFP基因转入病原菌中并表达，构建了病原菌的T-DNA插入突变体库，并通过筛选得到多个表型和致病性发生变化的突变体，为香蕉枯萎病菌基因组功能注释的研究奠定了基础。

香蕉枯萎病菌热带4号小种基因组规模分泌蛋白的预测与分析

为了明确香蕉枯萎病菌热带4号小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense tropical race 4,Foc TR4)与香蕉互作的分子机理,本研究利用SignalP、WoLF PSORT、TargetP、TMHMM和big-PI Predictor等软件,对Foc TR4全基因组22 487条蛋白质氨基酸序列进行了经典分泌蛋白的预测分析。结果表明,Foc TR4全基因组编码蛋白质中有1 054个经典分泌蛋白,占编码蛋白质总数的4.7%。蛋白质特征分析结果表明,其氨基酸序列长度集中在100~500个氨基酸,信号肽长度集中在17~22个氨基酸,信号肽切割位点以SPaseⅠ型为主。功能预测分析结果表明,有463个经典分泌蛋白获得了注释,主要涉及糖代谢、水解酶活性等。碳水化合物酶类(CAZymes)的分析结果表明,有281个分泌蛋白为CAZymes,其中以GH家族最多。此外,利用Secretome P软件对Foc TR4非经典分泌蛋白进行了分析,发现有9 216个蛋白质氨基酸序列,占编码蛋白质总数的41.0%。

香蕉枯萎病菌4号小种拮抗细菌的筛选与鉴定

为了筛选出对香蕉枯萎病菌具有拮抗作用的生物防治细菌菌株,从香蕉根际土中分离得到87株细菌菌株,采用平板对峙法,筛选出7株对香蕉枯萎病菌4号生理小种具有拮抗作用的菌株,并进行了抑制枯萎病菌4号小种菌丝生长和孢子萌发的试验。结果显示,拮抗菌株255、D5、F2、ZK11、214、215、252的发酵液对菌丝具有显著抑制效果,抑菌圈直径17.90～22.88 mm,并能使病菌菌丝产生畸形或泡囊状;对孢子萌发的抑制率64.40%～80.50%。通过对3株抑菌作用不同的拮抗菌株的16S rDNA鉴定和生理生化特性鉴定,结果显示,拮抗菌株255、D5和F2分别被初步鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheni-formis)。

香蕉枯萎病致病菌尖孢镰刀菌4号生理小种micro-like RNA及其靶标基因的鉴定

香蕉枯萎病已严重威胁香蕉产业的发展,为了分析香蕉枯萎病菌尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Fusarium oxysporum F. sp. cubense race 4,Foc4)中mi RNA-like(mil RNA)及其调控功能,本研究构建了3个Foc4菌丝小RNA测序文库,测序得到原始数据11783990条,其中可用于后续mil RNA鉴定的有效数据3351578条,通过与mi Rbase中植物mi RNA和已报道的真菌mil RNA进行比对,共预测出7个保守的和3个新型的mil RNA。进而利用降解组测序预测mil RNA靶基因,共预测出53对mil RNA-m RNA。通过对靶基因进行GO和KEGG富集分析,发现mil RNA与多个代谢通路有关,包括嘌呤代谢,甘油磷脂代谢,硫胺素代谢和三羧酸循环通路等,对真菌生长发育有重要影响;同时发现mil RNA靶向ABC转运器CDR4和孢子壁成熟蛋白DIT1,可能对Foc4致病过程具有重要影响。本研究在高通量测序获得mil RNA的基础上,首次在香蕉枯萎病致病菌Foc4中利用降解组测序分析了mil RNA靶基因,对研究真菌mil RNA调控提供了重要参考,也为香蕉枯萎病的防治提供了新的思路。

广西香蕉枯萎病菌4号生理小种对桂蕉6号的致病力分化研究

桂蕉6号是广西的主栽香蕉品种,占全区香蕉种植面积的90%以上。为了明确广西香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)4号生理小种对桂蕉6号的致病力,通过采集分离,获得41个香蕉枯萎病菌4号生理小种菌株,用伤根淋灌法接种香蕉组培苗。根据病菌对桂蕉6号的致病力强弱,上述菌株可以分为3类,其中强致病力菌株22个,中致病力菌株7个,弱致病力菌株12个,分别占供试菌株的53.66%、17.07%、29.27%。由此可见,广西香蕉枯萎病菌4号生理小种存在明显的致病力分化现象,强致病力菌株为优势种群。

根癌农杆菌介导的香蕉枯萎病1号生理小种遗传转化体系的优化

针对香蕉枯萎病病原菌的1号生理小（Fusariumoxysporumf.spcubenseracel，Focl），以潮霉素抗性为选择标记，建立了根癌农杆菌介导的转化体系，确定影响转化效率主要因子是：YEB平板上单菌落培养时间为40h、在LB液体摇床培养中培养时间28～30h（200r／min）、乙酰丁香酮（AS）浓度为200μmol]L、共培养温度为25℃、IM固体培养基pH值为5．5。在此条件下，转化效率能达到150-200个转化子／10s个Focl孢子。在选择性培养基筛选转化子时，我们首次采用了直接覆盖选择性培养基方法，比传统的转膜反贴方法更方便简单。在荧光显微镜下观察到转化子的绿色荧光。潮霉素抗性测试发现转化子的抗性表现稳定。

香蕉枯萎病菌4号生理小种密码子使用偏好性分析

为了解香蕉枯萎病4号生理小种基因组的密码子使用特点,掌握其基因编码规律,以香蕉枯萎病4号生理小种基因组的13 303条高置信蛋白的编码信息为数据来源,借助CodonW等软件对蛋白质的每个氨基酸编码数据进行统计分析,研究获得了UCC和CCC等8个密码子为最优密码子,第三个碱基为C的密码子具有更高的选择性。进一步统计分析了mRNA的编码区长度,发现密码子使用偏好性随着编码区的延长而降低,较长编码区的基因对密码子的使用无显著偏好性,为建立和优化香蕉枯萎病菌的遗传转化系统具有直接的指导作用。

南方根结线虫和香蕉枯萎病菌4号生理小种对香蕉复合致病力的测定

通过室内盆栽接种测试的方法,测定南方根结线虫(Moidogyne incognita)和香蕉枯萎病菌4号生理小种(Fusarium oxysporumf.sp.cubense race 4)对香蕉2个感枯萎病品种(巴西蕉和大蕉)和抗枯萎病品种(农科1号)的复合致病力。结果表明:对于供试的感病品种,先接种南方根结线虫能显著减轻香蕉枯萎病的发病程度;同时接种2种病原物和先接种香蕉枯萎病菌5d后接种南方根结线虫能加重香蕉枯萎病的发展;复合侵染能抑制南方根结线虫的种群数量,其中先接种香蕉枯萎病菌和同时接种2种病原物对南方根结线虫种群数量抑制作用更大;对于抗病的品种农科1号,2种病原物的同时接种能导致香蕉对枯萎病抗性的部分丧失。

香蕉枯萎病菌4号小种致病力分化的初步研究

为了研究中国香蕉枯萎病病原菌4号小种致病力分化的问题,2003年6月—2010年1月,通过采集或交流的方式共得到海南、广东、福建、云南和广西等省区的35个市县的56个Fusarium oxysporum f.sp.cubense Race4菌株,应用盆栽伤根淋灌法接种巴西蕉苗,系统性地评价了56个Race 4菌株的致病力。试验结果表明:供试的56个Race4菌株表现出了很明显的致病力分化,其中,强致病力的菌株有29个、中致病力的有9个、弱致病力的有18个,分别占供试菌株的51.79%、16.07%、32.14%。供试的香蕉枯萎病病原菌4号小种存在着明显的致病力分化现象,已分化为强、中和弱3种致病型,强致病力菌株为优势菌株。

香蕉枯萎病菌4号小种在各培养基上性状比较

通过K2、PPA、MBA和PSA等培养基对香蕉枯萎病菌4号小种的选择性和鉴别作用进行比较,结果表明,K2培养基抑制杂菌的能力强,适宜香蕉枯萎病菌4号小种生长,齿轮状菌落是该小种的鉴别特征.利用K2培养基从土壤中检测出的菌株在香蕉组培苗上进行致病性测定,确认该菌株为香蕉枯萎病菌4号小种.因此,K2培养基可以作为香蕉枯萎病菌4号小种的鉴别培养基,用于土壤、香蕉苗和田间病株中香蕉枯萎病菌4号小种检测.

香蕉枯萎病4号小种T-DNA插入突变体Focr4-1453表型特征及致病性分析

尖孢镰刀菌古巴转化型是引起香蕉枯萎病的主要病原菌,呈世界多态性分布,其致病机理尚不清楚。Focr4-1453为T-DNA插入突变体库中筛选出的一株与致病性相关的突变体。在克隆出其失活基因之后,将野生型菌株中的相同基因进行敲除和互补,得到敲除突变体ΔFoc4-1453和互补突变体ΔFoc4-1453-cp-1。对获得的3株突变体进行生物学表型研究发现,这些菌株的菌落生长速度、产孢能力以及孢子萌发率较野生型菌株明显降低,且无法透过玻璃纸进行生长。致病性测定试验表明,该基因失活会导致病原菌侵染能力显著减弱。