广西香蕉枯萎病病原菌4号生理小种的分子检测与鉴定

【目的】明确在广西个别香蕉产区发现的香蕉枯萎病病原种类,为防控该病害提供科学依据。【方法】从广西不同香蕉产区采集香蕉枯萎病病株样本,分离纯化获得6株菌株,以香蕉枯萎病1号和4号生理小种为阳性对照,采用特异PCR的方法,对分离到的6株菌株进行分子检测,并用盆栽香蕉和西贡蕉小苗接种进行菌株致病性鉴定。【结果】经ST1/ST2特异引物扩增,1号菌株与香蕉枯萎病菌1号生理小种扩增到约200bp片段;2～6号菌株和香蕉枯萎病菌4号生理小种扩增到约250bp片段。与标样对比结果表明,1号菌株为香蕉枯萎病1号生理小种,2～6号菌株为香蕉枯萎病4号生理小种;盆栽接种致病性鉴定结果与分子检测结果相同。【结论】广西个别蕉区已遭受香蕉枯萎病菌4号小种侵染,各级部门应高度重视。

香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的快速检测与鉴定

【目的】从香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种特有的基因序列入手,建立一种快速可靠的分子检测技术,为防止香蕉枯萎病的传播蔓延、尽早采取防治对策、指导香蕉生产进行品种配置提供理论依据。【方法】根据研究室已经筛选到的4号生理小种候选致病相关基因序列设计引物,分别以来自海南、广东和广西的6个香蕉枯萎病菌1号生理小种菌株、7个4号生理小种菌株、7个尖镰孢其它专化型菌株以及2个外围菌株DNA为模板进行PCR扩增,筛选香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种特异性引物及尖镰孢菌的通用引物。【结果】筛选到的特异性引物不仅可用于香蕉枯萎病菌DNA的检测,还可直接用于对罹病香蕉组织和土壤中的香蕉枯萎病菌的检测;筛选到的尖镰孢菌通用引物,可作为内参照以检测DNA的质量,以避免假阴性情况的出现。【结论】所建立的三重PCR检测方法实现了在一次PCR反应中快速、准确地同步检测香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种,对检测香蕉苗是否感染枯萎病及蕉园土壤是否受到香蕉枯萎病菌的污染具有重要意义。

农杆菌介导的香蕉枯萎病菌4号生理小种转化体系的优化

香蕉枯萎病是世界范围内香蕉种植区最为严重的病害之一,严重威胁和影响着香蕉产业的发展。本文针对香蕉枯萎病病原菌的4号生理小种,建立了农杆菌介导的转化体系,确定了影响转化效率主要因子的优化体系是:农杆菌在IM培养基诱导前农杆菌OD600为0.15、农杆菌经IM液体培养基诱导的时间为7h、乙酰丁香酮(AS)浓度为150μmol/L、Focr4孢子浓度为1×106个/mL、共培养时间为48h、培养温度为25℃、诱导培养基pH值为5.5。在此条件下,转化效率能达到700～800个转化子/106个香蕉枯萎病菌孢子。PCR验证表明外源的T-DNA已经成功随机地整合到该病原菌基因组中。目前,应用该转化体系已获得2300多个转化子,为后续克隆相关致病基因打下了良好基础。

香蕉枯萎病菌4号生理小种农杆菌介导遗传转化体系的建立及T-DNA插入突变体的筛选

【目的】通过农杆菌介导的遗传转化（ATMT）方法，建立香蕉枯萎病4号生理小种的高效转化体系，构建病原菌的突变体库并进行筛选，为已突变基因提供分子标记，在分子水平上对香蕉枯萎病菌的功能基因进行深入研究。【方法】通过单因子变量（试验材料、真菌孢子浓度、农杆菌预诱导终浓度、IM诱导培养基pH、共培养介质、共培养时AS浓度、共培养温度）试验，研究影响农杆菌介导的遗传转化效率的关键因素，并通过形态观察与致病性试验筛选突变体。【结果】得到的最佳转化条件为：农杆菌预诱导浓度OD600=0.8，病原菌孢子浓度106 CFU/mL，转化受体材料为分生孢子，共培养培养基pH 5.4，共培养温度25 ℃，共培养培养基中AS浓度200 μmol/L，共培养介质为硝酸纤维素膜。通过条件优化，转化效率可达到800-900个转化子/106个孢子。【结论】通过农杆菌介导的遗传转化成功将GFP基因转入病原菌中并表达，构建了病原菌的T-DNA插入突变体库，并通过筛选得到多个表型和致病性发生变化的突变体，为香蕉枯萎病菌基因组功能注释的研究奠定了基础。

香蕉枯萎病致病菌尖孢镰刀菌4号生理小种micro-like RNA及其靶标基因的鉴定

香蕉枯萎病已严重威胁香蕉产业的发展,为了分析香蕉枯萎病菌尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Fusarium oxysporum F. sp. cubense race 4,Foc4)中mi RNA-like(mil RNA)及其调控功能,本研究构建了3个Foc4菌丝小RNA测序文库,测序得到原始数据11783990条,其中可用于后续mil RNA鉴定的有效数据3351578条,通过与mi Rbase中植物mi RNA和已报道的真菌mil RNA进行比对,共预测出7个保守的和3个新型的mil RNA。进而利用降解组测序预测mil RNA靶基因,共预测出53对mil RNA-m RNA。通过对靶基因进行GO和KEGG富集分析,发现mil RNA与多个代谢通路有关,包括嘌呤代谢,甘油磷脂代谢,硫胺素代谢和三羧酸循环通路等,对真菌生长发育有重要影响;同时发现mil RNA靶向ABC转运器CDR4和孢子壁成熟蛋白DIT1,可能对Foc4致病过程具有重要影响。本研究在高通量测序获得mil RNA的基础上,首次在香蕉枯萎病致病菌Foc4中利用降解组测序分析了mil RNA靶基因,对研究真菌mil RNA调控提供了重要参考,也为香蕉枯萎病的防治提供了新的思路。

广西香蕉枯萎病菌4号生理小种对桂蕉6号的致病力分化研究

桂蕉6号是广西的主栽香蕉品种,占全区香蕉种植面积的90%以上。为了明确广西香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)4号生理小种对桂蕉6号的致病力,通过采集分离,获得41个香蕉枯萎病菌4号生理小种菌株,用伤根淋灌法接种香蕉组培苗。根据病菌对桂蕉6号的致病力强弱,上述菌株可以分为3类,其中强致病力菌株22个,中致病力菌株7个,弱致病力菌株12个,分别占供试菌株的53.66%、17.07%、29.27%。由此可见,广西香蕉枯萎病菌4号生理小种存在明显的致病力分化现象,强致病力菌株为优势种群。

香蕉枯萎病菌4号生理小种密码子使用偏好性分析

为了解香蕉枯萎病4号生理小种基因组的密码子使用特点,掌握其基因编码规律,以香蕉枯萎病4号生理小种基因组的13 303条高置信蛋白的编码信息为数据来源,借助CodonW等软件对蛋白质的每个氨基酸编码数据进行统计分析,研究获得了UCC和CCC等8个密码子为最优密码子,第三个碱基为C的密码子具有更高的选择性。进一步统计分析了mRNA的编码区长度,发现密码子使用偏好性随着编码区的延长而降低,较长编码区的基因对密码子的使用无显著偏好性,为建立和优化香蕉枯萎病菌的遗传转化系统具有直接的指导作用。

南方根结线虫和香蕉枯萎病菌4号生理小种对香蕉复合致病力的测定

通过室内盆栽接种测试的方法,测定南方根结线虫(Moidogyne incognita)和香蕉枯萎病菌4号生理小种(Fusarium oxysporumf.sp.cubense race 4)对香蕉2个感枯萎病品种(巴西蕉和大蕉)和抗枯萎病品种(农科1号)的复合致病力。结果表明:对于供试的感病品种,先接种南方根结线虫能显著减轻香蕉枯萎病的发病程度;同时接种2种病原物和先接种香蕉枯萎病菌5d后接种南方根结线虫能加重香蕉枯萎病的发展;复合侵染能抑制南方根结线虫的种群数量,其中先接种香蕉枯萎病菌和同时接种2种病原物对南方根结线虫种群数量抑制作用更大;对于抗病的品种农科1号,2种病原物的同时接种能导致香蕉对枯萎病抗性的部分丧失。

广西香蕉枯萎病4号生理小种发生情况及香蕉品种抗性鉴定

【目的】明确香蕉枯萎病4号生理小种在广西的发生实况和广西现有香蕉品种对香蕉枯萎病4号生理小种的抗性水平,为制定相应的防控措施提供参考。【方法】在广西香蕉产区随机选择23个村,每村抽取2～3个点,调查香蕉枯萎病4号生理小种的发生情况。用伤根接种法测定11个香蕉品种对香蕉枯萎病4号生理小种的抗性水平。【结果】南宁市西乡塘区、隆安县、钦州市、武鸣县和龙州县均发现香蕉枯萎病4号生理小种发生为害,大多数发病地块的病株率在1.00%～14.00%,病情指数在0.50～10.00,田东县调查点没有发现香蕉枯萎病4号生理小种为害。11个香蕉品种除金粉1号病情指数为50.00,为感病品种(S)外,其他品种病情指数在70.00～100.00,为高感品种(HS)。【结论】香蕉枯萎病4号生理小种已在广西部分产蕉区零星发生,正处于病原菌菌量累积阶段;目前广西栽种的香蕉品种均为感病或高感品种,抵御能力差,需加强对香蕉枯萎病的防控力度。

海南省香蕉枯萎病病原菌的分离鉴定及1号、4号小种的生物学特性

香蕉枯萎病是目前国内和世界很多地区香蕉种植区的一种毁灭性病害,目前尚未找到有效的防治方法。本文采集了海南省不同地区香蕉枯萎病的病原菌,通过经典病理学与分子生物学的方法进行了鉴定,此外还优化了快速检测的方法。结果表明,通过接种巴西香蕉和粉蕉进行致病性检测以及分离菌rDNA-ITS测序结果,明确鉴定出供试的香蕉分离菌株为4号生理小种,粉蕉分离菌株为1号生理小种。为了对1号、4号生理小种有更多的了解,本文还对1号、4号小种菌株生物学特性进行了测定,确定了影响菌丝生长的最佳条件。结果显示,pH5时最适合1号、4号生理小种的菌丝生长,适合菌丝生长的温度为19～28℃之间,温度达到37℃时菌丝不能生长,碳源对菌丝的生长影响不大。这些方法和数据可以有利于田间香蕉枯萎病病害的检测和最终确定,生物学特性的测定可以为耕作技术的改进和农药的研发提供参考依据。

香蕉枯萎病菌热带4号小种基因组规模分泌蛋白的预测与分析

为了明确香蕉枯萎病菌热带4号小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense tropical race 4,Foc TR4)与香蕉互作的分子机理,本研究利用SignalP、WoLF PSORT、TargetP、TMHMM和big-PI Predictor等软件,对Foc TR4全基因组22 487条蛋白质氨基酸序列进行了经典分泌蛋白的预测分析。结果表明,Foc TR4全基因组编码蛋白质中有1 054个经典分泌蛋白,占编码蛋白质总数的4.7%。蛋白质特征分析结果表明,其氨基酸序列长度集中在100~500个氨基酸,信号肽长度集中在17~22个氨基酸,信号肽切割位点以SPaseⅠ型为主。功能预测分析结果表明,有463个经典分泌蛋白获得了注释,主要涉及糖代谢、水解酶活性等。碳水化合物酶类(CAZymes)的分析结果表明,有281个分泌蛋白为CAZymes,其中以GH家族最多。此外,利用Secretome P软件对Foc TR4非经典分泌蛋白进行了分析,发现有9 216个蛋白质氨基酸序列,占编码蛋白质总数的41.0%。

5株香蕉枯萎病菌(Foc4)菌株对桂蕉6号的致病力测定

【目的】了解桂蕉6号在广西对不同来源香蕉枯萎病菌4号小种(Foc4)的抗性,并筛选出强致病力菌株,为香蕉新品种抗性鉴定提供备选鉴别菌株。【方法】采用盆栽伤根淋灌法分别将不同来源的Foc4菌株(J-2、SD-2、T-2、W-2、F-2)同期接种于苗期香蕉品种桂蕉6号,并于接种后10、15、20、25和30 d观察植株叶部发病症状,30 d时解剖蕉苗球茎,观察球茎的变化。综合受侵染后桂蕉6号内外部症状,评价不同菌株的致病力。【结果】SD-2、J-2、T-2和W-2菌株对桂蕉6号均具有较强的致病力,其中SD-2和J-2致病力最强,接种10 d后植株叶片边缘开始变黄,15 d植株叶片黄化明显,30 d后植株矮化、弱小,甚至枯死;接种T-2、W-2后20 d,香蕉植株也出现黄化,但植株仍能正常生长;F-2致病力相对较弱,但仍属中等致病力菌株。【结论】桂蕉6号为感病品种,在种植中应加强对枯萎病的防控。在香蕉枯萎病抗病品种选育时,可选用致病力较强的J-2和SD-2作为备选鉴别菌株。

广西香蕉枯萎病4号生理小种发生特点调查

2014—2015年采用随访调查、抽样、跟踪调查等方法,调查广西7个香蕉主产区的枯萎病发生情况,并结合植株生育期、种植代数、灌溉模式及病原菌的周年发生规律进行调查与分析。结果表明,香蕉枯萎病4号生理小种在广西几大香蕉主产区均有不同程度发生,2015年平均发病率由2014年的2.48%上升为5.78%,且发展蔓延迅速,其中钦州市发生最重,发病率达到了15.31%。8—10月是发病高峰期;香蕉孕蕾抽蕾期至幼果期是发病敏感期;香蕉种植代数越长,发病率越高;滴灌及微滴灌模式可有效减缓枯萎病发生。

香蕉枯萎病菌4号小种致病力分化的初步研究

为了研究中国香蕉枯萎病病原菌4号小种致病力分化的问题,2003年6月—2010年1月,通过采集或交流的方式共得到海南、广东、福建、云南和广西等省区的35个市县的56个Fusarium oxysporum f.sp.cubense Race4菌株,应用盆栽伤根淋灌法接种巴西蕉苗,系统性地评价了56个Race 4菌株的致病力。试验结果表明:供试的56个Race4菌株表现出了很明显的致病力分化,其中,强致病力的菌株有29个、中致病力的有9个、弱致病力的有18个,分别占供试菌株的51.79%、16.07%、32.14%。供试的香蕉枯萎病病原菌4号小种存在着明显的致病力分化现象,已分化为强、中和弱3种致病型,强致病力菌株为优势菌株。

香蕉枯萎和细菌性软腐病菌的多重PCR检测

香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense和细菌性软腐病菌Dickeya zeae的复合侵染为害给香蕉产业发展带来严重挑战,有必要建立相关病害的多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction, multiplex PCR)检测技术。本文基于尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种(F.oxysporum f.sp.cubense race 1,FOC1)基因组contig 438区间(35 631-37 693 bp)(GenBank:AMGP01000438.1)和4号生理小种(F.oxysporum f.sp.cubense race 4,FOC4)基因组contig 195区间(4 028-6 126 bp)(GenBank:AMGQ01000195.1)存在160 bp插入序列差异设计特异扩增引物FOC-F/-R,同时以香蕉细菌性软腐病菌D.zeae的促旋酶B亚单位基因(the subunit B of gyrase gene)(GenBank:JQ284039)序列设计特异扩增引物gyrB-F/-R。多重PCR检测结果显示:本技术可在一次PCR扩增反应内同时检测香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种和细菌性软腐病菌;多重PCR的灵敏度结果表明:检测香蕉枯萎病菌的DNA浓度最低限为0.1 ng/μL,细菌性软腐病菌的灵敏度为103cfu/mL;检测结果稳定可靠。因此,本研究建立的多重PCR检测方法可有效应用于检测香蕉发病组织中的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌,也可用于香蕉种苗和田间土壤带病菌的监测,为香蕉种植保驾护航。

香蕉枯萎病4号小种T-DNA插入突变体Focr4-1453表型特征及致病性分析

尖孢镰刀菌古巴转化型是引起香蕉枯萎病的主要病原菌,呈世界多态性分布,其致病机理尚不清楚。Focr4-1453为T-DNA插入突变体库中筛选出的一株与致病性相关的突变体。在克隆出其失活基因之后,将野生型菌株中的相同基因进行敲除和互补,得到敲除突变体ΔFoc4-1453和互补突变体ΔFoc4-1453-cp-1。对获得的3株突变体进行生物学表型研究发现,这些菌株的菌落生长速度、产孢能力以及孢子萌发率较野生型菌株明显降低,且无法透过玻璃纸进行生长。致病性测定试验表明,该基因失活会导致病原菌侵染能力显著减弱。

南方根结线虫、香蕉穿孔线虫和尖孢镰刀菌4号生理小种对巴西蕉致病力的测定

通过室内盆栽接种测试的方法,测定南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)和尖孢镰刀菌4号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4)对巴西蕉的致病力。结果表明:3种病原微生物进行单独侵染和复合侵染均能抑制巴西蕉的生长,且复合侵染对巴西蕉的生长量影响更大;南方根结线虫单独侵染巴西蕉的根结指数要比复合侵染的高;香蕉穿孔线虫单独侵染巴西蕉的病情指数要比复合侵染的高;而尖孢镰刀菌4号生理小种与根结线虫和香蕉穿孔线虫同时侵染巴西蕉时香蕉枯萎病病情指数相对最高。

4种三唑类杀菌剂对香蕉枯萎病菌的抑制效果及其差异性

香蕉枯萎病由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc)侵染引起,正严重威胁着我国香蕉产业,目前尚无有效的化学防治措施。本研究通过测定菌丝生长速率比较了香蕉枯萎病菌热带4号生理小种(Foc tropical race 4, Foc TR4)对4种常用三唑类杀菌剂的敏感性,发现丙硫菌唑、戊唑醇、丙环唑、腈菌唑对Foc TR4的抑制作用依次减小。通过菌丝形态观察、相对电导率测定和丙二醛含量测定发现,与对照组相比,4种杀菌剂均可引起Foc TR4菌丝分枝增多、不规则扭曲,表面干瘪、凹陷和扁平化等畸形现象,使得菌丝细胞膜通透性和丙二醛含量显著性增加。三唑类杀菌剂可增大细胞色素P450酶活性并显著性上调细胞色素P450甾醇14α-脱甲基酶(cytochrome P450 sterol 14α-demethylase, CYP51)基因CYP51-1、CYP51-3的表达。本研究还通过分子对接和表面等离子共振试验明确了4种三唑类杀菌剂与Foc TR4中CYP51的互作模式差异,发现虽然丙硫菌唑对Foc TR4的生物活性优于其他3种杀菌剂,但是其与CYP51的亲和力最弱,说明丙硫菌唑与CYP51的作用方式存在特异性。本研究可为防治香蕉枯萎病菌Foc的新型杀菌剂的筛选和合理设计提供一定的理论参考。

厄瓜多尔:引进抗枯萎病香蕉新品种

厄瓜多尔将采收第二种抗香蕉枯萎病的香蕉品种——以色列的GAL品种。香蕉枯萎病病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种热带型。GAL品种是该国进口的第二种对抗香蕉枯萎病的香蕉品种,第一种是2022年4月引进的新北蕉品种(Formosana 218)。

香蕉抗(耐)枯萎病新品种桂蕉9号的选育及其高产栽培技术

【目的】选育抗（耐）尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种（FOC4）引起的香蕉枯萎病,且产量、品质性状优良的香蕉新品种,丰富广西抗（耐）枯萎病香蕉品种,为促进广西香蕉产业的健康持续发展提供技术支持。【方法】采用重病蕉区大田筛选母株,并利用组织培养芽变、盆栽接种病原菌压力选择及大田病区压力选择相结合的方法选育抗（耐）香蕉枯萎病品种,经过品系纯化、品比试验、区域试验、生产试验等,观察其特征特性、抗病性及产量表现等。【结果】桂蕉9号为巴西蕉芽变异株系,基因型为AAA,属中秆香蕉,全生育期310～350 d;果肉可溶性固形物含量22.3%,总糖含量19.6 mg/100 g,维生素C（Vc）含量16.38 mg/100 g,可滴定酸含量0.43%;果实具有较好的耐贮性,催熟后在室温下可保存3～5 d。2012～2015年在海南、广东及广西进行种植试验,桂蕉9号对由FOC4引起的枯萎病表现出抗（耐）性,1代及2代香蕉植株的田间发病率为0.95%～52.30%,比对照品种（巴西蕉、桂蕉6号、桂蕉1号）减少7.38%～88.70%（绝对值）;1代及2代蕉单株平均产量为19.8～29.6 kg,总产量17001.0～74485.4 kg/ha,比对照品种增产-2.1%～515.5%。桂蕉9号于2015年6月通过广西农作物品种审定委员会审定。【结论】桂蕉9号是广西首个自主育成的抗（耐）香蕉枯萎病新品种,适宜在广西、云南、海南等香蕉主产区种植。