香蕉线条病毒MP功能域基因的克隆、原核表达及抗血清制备

[目的]制备香蕉线条病毒广东分离物（ BSV-GD） MP功能域基因编码蛋白的多克隆抗血清，为BSV基因编码蛋白功能的研究提供条件．[方法]对BSV-GD ORF3基因氨基酸序列进行生物信息学分析，得出MP功能域基因序列，克隆该基因并插入载体pET-28b（＋）构建原核表达载体，经IPTG诱导表达后，采用超声波裂解法进行蛋白可溶性分析，利用组氨酸标签纯化试剂盒对目的融合蛋白进行纯化和回收，然后以纯化的目的蛋白为抗原免疫健康家兔制备其多克隆抗血清；通过Western-blot分析该抗血清的特异性，间接ELISA法检测该抗血清的效价．[结果和结论]MP功能域基因在ORF3中的序列为61～311 aa处，核酸序列长753 bp．试验克隆了该基因并成功构建了其原核表达载体pET28b-MP，经IPTG诱导1 h后表达了相对分子质量约为30800的融合蛋白6His＆#183; MP．可溶性分析表明该融合蛋白以包涵体形式存在，纯化获得了高纯度的目的融合蛋白，以其为抗原成功制备了BSV-GD MP功能域基因编码蛋白的多克隆抗血清；分析表明该抗血清具有很强的特异性，其效价高达204800倍以上．

香蕉线条病毒ORF I基因的原核表达及抗体制备

利用PCR方法从含香蕉线条病毒广东分离物(BSV-GD)部分基因组的质粒中扩增该病毒的ORF I基因,将其克隆到pET-28b(+)原核表达载体中进行了融合表达.SDS-PAGE电泳发现,目的融合蛋白与预期大小一致,相对分子质量约为23 000,表达产物主要以不可溶的包涵体形式存在,将其变性溶解后利用N端的组氨酸标签进行纯化.以纯化产物为抗原免疫兔子制备了香蕉线条病毒的阳性兔抗血清,Western blot和ELISA分析表明,制备的兔抗血清为香蕉线条病毒的高效特异性抗血清,效价高达1∶51 200.

整合态香蕉线条病毒研究进展

综述了整合态香蕉线条病毒的相关研究进展,重点介绍了整合态香蕉线条病毒的同源重组游离机制、主要由基因遗传和表观遗传等介导的调控机制及其生物学意义,并对整合态病毒研究进行了展望,以期为研究香蕉和香蕉线条病毒共同进化及互作提供参考依据。

香蕉线条病毒衣壳蛋白功能域基因的原核表达及抗血清制备

制备香蕉线条病毒广东分离物（BSV-GD）的抗血清，可为BSV-GD的快速检测和进一步研究BSV编码蛋白的功能提供条件。通过常规分子生物学方法，克隆了BSV-GD衣壳蛋白（Coatprotein，CP）功能域基因，构建了该基因的原核表达载体pET28b．CP，并诱导表达了大小约为46．5kD的融合蛋白His-CP。可溶性分析表明该融合蛋白以包涵体形式存在。利用His标签纯化试剂盒对目的蛋白进行纯化、回收，获得了高纯度的融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原免疫健康大耳白兔，成功制各了BSV-GDcP功能域基因编码蛋白的兔抗血清。Western．blotting分析表明该抗血清具有很强的特异性，间接ELISA法检测抗血清效价达204800倍以上，对植物材料的合适检测浓度为1：1600～1：6400。

香蕉3种病毒的多重PCR检测体系

根据GenBank中已发表的香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)﹑黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和香蕉线条病毒(Banana streak virus,BSV)的基因序列,找出保守序列分别设计出特异引物,在建立各种病毒单项PCR技术的基础上,通过优化多重PCR反应条件,建立了能同时检测3种病毒的多重PCR检测体系。该体系可同时扩增BBTV的615bp、CMV的480bp和BSV的945bp的特异片段。这些片段克隆测序结果表明,多重PCR扩增的不同病毒片段是特异和专化的,其核苷酸序列与相应的病毒基因片段的相似性都达91%以上。该体系的灵敏度测定结果表明,从相当于或大于10-2mg感病植物组织中均能检测到这3种病毒。

香蕉3种主要病毒的多重PCR检测

根据香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和香蕉线条病毒(Banana streak virus,BSV)3种病毒核酸保守序列设计相应特异性引物,通过体系优化,建立了可以同时检测香蕉束顶病毒、黄瓜花叶病毒、香蕉线条病毒的多重PCR体系。

应用TaqMan real-time PCR研究BSV在带毒香蕉组培苗中传递

由香蕉线条病毒(Banana streak virus,BSV)引起的香蕉线条病,严重影响了香蕉产量及种质资源交流。本研究根据BSV ORF Ⅲ基因保守序列设计引物和探针,建立了BSV的实时荧光定量PCR检测方法。该法检测BSV时,与黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)无交叉反应;不论是检测质粒DNA还是香蕉病株总DNA,其灵敏度都比普通PCR高,检测质粒DNA的灵敏度比普通PCR高100倍,检测香蕉病株总DNA的灵敏度比普通PCR高10倍,且具有良好的重复性。利用建立的实时荧光定量PCR方法检测我国主栽的不同香蕉品种‘大蕉’、‘粉蕉’和‘粤优抗一号’香蕉组培苗中BSV的浓度,发现不同品种BSV传递规律不同。‘大蕉’第3代、第9代组培分化芽中BSV含量较原代显著减少;‘粉蕉’中BSV含量随继代数增加表现为先增加后减少;‘粤优抗一号’中BSV含量随继代数增加呈增加趋势。BSV在‘粉蕉’、‘大蕉’和‘粤优抗一号’第10代到第12代组培苗中以顶部第1片或(及)第2片叶中含量最高。直接结合PCR分析初步表明不同品种在原代和组培至第12代,其植株中的BSV均为游离状态。本文通过对带毒香蕉组培苗中BSV的含量监测,明确了BSV在不同品种带毒香蕉组培苗中的传递和分布规律,为研究BSV与寄主互作及BSV检测提供了理论依据。