香蕉花叶病毒外壳蛋白基因克隆及表达载体的构建

从海南大田感染香蕉花叶病的香蕉叶片 ,获得香蕉花叶病毒 ,提纯其 RNA,在 AMV反转录酶作用下合成 c DNA第一链 ,经 PCR扩增 ,获得一约 70 0 bp的 DNA片段 ,测序结果显示所克隆的 DNA片段包含一完整的香蕉花叶病毒株系 ( CMV-BHI)外壳蛋白基因 ,长度为 6 5 7bp,然后将此 DNA片段 ,分别克隆到p BI1 2 1和 p KHG4质粒 ,构成两个含 Ca MV35 s启动子 ( 5 '-端 )、NOS终止子 ( 3'-端 )和分别含 NPT 标记基因和 NPT 及 HPT标记基因的植物表达载体 ( p TBB和 p TBK)。然后用 p AHC1 8中的 UBI promoter换下p BI1 2 1的 Ca MV35 s promoter,构成 p BIAH;再用 CMV-BHI外壳蛋白基因换下 p BIAH中 GUS基因 ,构成一含单子叶植物启动子 UBI和 NPT 标记基因的植物表达载体 ( p TBBU)。从而为

香蕉花叶病毒外壳蛋白基因的分离测序和比较

从海南大田感染花叶病毒的香蕉叶片中分离病毒及其ＲＮＡ，在ＡＭＶ逆转录酶作用下以ＲＮＡ为模板反转录合成ｃＤＮＡ第一链，并在此基础上进行ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｃｒａｓｃＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）扩增，得一１ｋｂ左右片段。补平后克隆到ｐＢＳ质粒的ＥｃｏＲＶ位点，测得该片段长９８６ｂｎ。分析表明它包含有完整的香蕉花叶病毒外壳蛋白基因，其编码区的核苷酸序列与ＣＭＶ－Ｃ株系的同源率为８８；６％，ＣＭＶ－Ｑ株系为７５．０％；氨基酸残基序列与ＣＭＴ－Ｃ株系同源率为８５．８％，ＣＭＶ－Ｑ株系为６４．４％。

黄瓜花叶病毒香蕉株系(CMV-Xb)RNA3 cDNA的克隆和序列分析

通过RT PCR方法 ,设计两对引物 ,克隆了黄瓜花叶病毒香蕉株系 (CMV Xb)RNA3 ,并进行了核苷酸和蛋白质水平上的分析。结果表明Xb株系RNA3全长 2 2 0 5nt,具有两个蛋白编码阅读框架 (ORF) ,其中 5’端 (97～ 936nt)编码一个 2 79aa的 3a蛋白 ;3’端 (12 2 5～ 1871nt)编码一个 2 18aa的CP蛋白。 5’非编码区域为 96nt;基因间隔区 (IR)长2 88nt;3’NR含有 32 4nt。通过与亚组Ⅱ其它株系RNA3核苷酸和所编码产物推导的氨基酸序列分析发现 ,亚组Ⅱ株系无论在编码区还是非编码区的核苷酸同源性都相对较高 ;亚组Ⅱ株系在进化过程中具有连续性。

实时荧光RT-PCR检测香蕉苞片花叶病毒方法的建立

香蕉苞片花叶病毒(Banana bract mosaic virus,BBrMV)是我国对外检疫性有害生物。为防止该有害生物传入我国,根据BBrMV不同分离株外壳蛋白基因(coat protein,CP)的保守序列,设计特异性引物与TaqMan荧光探针,建立了BBrMV的实时荧光RT-PCR检测方法。结果表明,该方法检测BBrMV的2个不同来源毒株,均能够得到典型扩增曲线,Ct值分别为26.65和27.52;而马铃薯Y病毒、李属坏死环斑病毒以及桃丛簇花叶病毒等其它毒株则没有典型扩增曲线,也无Ct值。灵敏度比较发现,该方法比普通RT-PCR检测方法的灵敏度提高1000倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适合对BBrMV的检测。

香蕉苞片花叶病毒CP基因的原核表达及抗血清制备

本试验成功构建了香蕉苞片花叶病毒(Banana bract mosaic virus,BBrMV)外壳蛋白(coat pro-tein,CP)基因的原核表达载体,并诱导表达了34 kDa的融合蛋白His.CP。对该原核表达蛋白的可溶性分析表明,该融合蛋白以包涵体形式存在。利用组氨酸标签纯化试剂盒对目的蛋白进行了纯化,获得了高纯度的融合蛋白。以纯化的蛋白为抗原免疫健康家兔,成功制备了抗BBrMV CP基因编码蛋白的兔抗血清。Western-blotting结果表明这种抗血清有很强的特异性。血清效价测定的效价在51 200倍以上,对植物材料的合适检测浓度为1:800～1:3 200。