烟草苯丙烷代谢途径关键酶肉桂酸-4-羟化酶、4-香豆酸-辅酶A基因的分离及表达特性分析

肉桂酸-4-羟化酶(C4H)、4-香豆酸-辅酶A(4CL)是烟草苯丙烷代谢途径的关键酶,其多酚类产物与烟草品质密切相关。本研究以酚类物质含量合成差异较大的2个烤烟品种红花大金元(HD)和K326为试验材料,利用同源克隆技术获得这2种烟草Ntc4h和Nt4cl基因的cDNA序列并进行表达特性分析。结果表明,在2个品种中Ntc4h和Nt4cl各有2个同源基因,Ntc4h1、Ntc4h2、Nt4cl1和Nt4cl2的ORF长度分别为1518 bp、1518 bp、1644 bp和1629 bp。Nt4cl1、Ntc4h1和Ntc4h2在编码序列上存在品种间差异。实时荧光定量PCR分析结果表明,该2种酶的基因在烟草中具有明显的时空表达特异性,2种酶基因在根、茎、叶、花和萼片中都有表达,在茎的木质部和韧皮部中的表达量均显著高于其他组织;在圆顶期和适熟期表达水平较高,在适熟期达到最高;且两品种中的表达模式存在差异。

毛竹香豆酸-3-羟基化酶基因的克隆与表达研究

香豆酸-3羟-基化酶(C3H)是木质素单体合成中的一个关键酶。采用文库筛选的方法从毛竹萌发种子全长cDNA文库中克隆了1个C3H基因,命名为PheC3H。PheC3H基因全长1842bp,包括1个完整的开放阅读框,编码1个由513个氨基酸残基组成的蛋白(PheC3H),C端具有1个细胞色素P450蛋白(CYP450)特异的保守结构域。相似性比对显示,PheC3H与其他植物的C3H有着较高的相似性,其中与小麦的CYP98A蛋白相似性最高,达91.2%;聚类分析表明,PheC3H属于CYP98A亚家族蛋白;实时定量PCR结果表明,PheC3H在一年生实生毛竹叶鞘中表达量最高,其次是在根中,在叶片和茎中表达量相对较低。

金银花香豆酸3-羟化酶基因LjC3H2的生物信息学分析

香豆酸3-羟化酶广泛存在于植物中,属于细胞色素P450家族的CYP98A亚家族。该酶能在植物苯丙素代谢中催化苯环C3位置的羟基化反应,是绿原酸生物合成的关键酶之一。本文以金银花香豆酸3-羟化酶基因LjC3H2为研究对象,采用生物信息学方法进行分析。结果表明,LjC3H2无信号肽,无跨膜结构域,偏亲水,定位于内质网上;二级结构以α螺旋为主,无规则卷曲较多。LjC3H2与其他植物同源蛋白氨基酸序列比对和系统发育分析表明,LjC3H2与蓟、桔梗的C3H亲缘关系较近,与同属于金银花的LjC3H亲缘关系较远;该蛋白的三级结构与细胞色素P450三级结构相似。

当归香豆酸-3-羟化酶基因ASC3H的克隆及表达模式与阿魏酸含量相关性分析

目的:对当归中香豆酸-3-羟化酶基因(C3H)全长进行克隆,进行生物信息学与基因表达模式分析,结合当归根不同组织部位阿魏酸的含量,推测ASC3H基因功能。方法:基于前期转录组测序结果,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)克隆全长cDNA序列,运用生物信息学方法分析该序列特征,并利用Real-time PCR和高效液相色谱法(HPLC)分别测定当归不同组织中ASC3H基因表达量及阿魏酸含量。结果:克隆获得当归ASC3H全长基因(登录号MN2550298),开放阅读框(ORF)长度为1530 bp,编码509个氨基酸,理论相对分子质量为57.86 kDa,等电点8.36,为不含信号肽的亲水性不稳定蛋白,定位于叶绿体中,有跨膜区,具有多个磷酸化位点,含有细胞色素P450的保守结构域CGYDWPKGYGPIINVW_P450(383~399 aa);多重氨基酸序列比对分析结果显示ASC3H与其他植物的C3H基因具有较高相似性,并与同科植物大阿米芹的同源性最高;Real-time PCR结果显示ASC3H基因在当归不同组织的表达量不同;HPLC结果表明阿魏酸成分在当归根皮层组织含量最高,周皮、中柱次之。结论:成功获得当归C3H基因序列,分析了其蛋白结构与特异性表达特征,推测ASC3H可能参与当归阿魏酸的合成,为进一步研究C3H基因在当归阿魏酸生物途径中的功能提供了参考依据,也为遗传改良当归品质奠定了研究基础。

丹参香豆酸-3-羟化酶基因(SmC3H)的生物信息学及其组织表达模式分析

通过分析丹参转录组数据库(SRX021907)得到一条香豆酸-3-羟化酶(C3H)基因,blast比对发现该基因为丹参C3H(EU358957.1),该基因c DNA全长1 704 bp,包括1个1 503 bp的开放阅读框,编码508个氨基酸。生物信息学分析表明,其编码蛋白的分子量为57.21 k D,等电点为8.53,含琢-螺旋,延伸链和无规则卷曲,具有1个细胞色素P450蛋白(CYP450)特异的保守结构域。聚类分析表明其与芝麻的亲缘关系最近。组织特异性表达分析结果表明,该基因在茎中的表达量最丰富,其次是叶和花,根中最低。

棉花4-香豆酸辅酶A连接酶基因克隆及原核表达

本研究从棉花中克隆了一个4CL基因,命名为Gh4CL2(GenBank登录号为FJ848870)。研究结果表明:Gh4CL2基因cDNA全长2332bp,具有一个1725bp的开放阅读框,5′非编码区为64bp,3′非编码区为543bp,编码574个氨基酸,预测分子量约为62.106kD,等电点为5.94。氨基酸同源性分析发现,Gh4CL2与来自白杨、大豆和紫草的4CL一致性较高。进一步研究Gh4CL2基因的功能,构建了该基因的原核表达载体pET-28a-4CL2,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE分析表明,最佳诱导表达条件为0.5mmol/LIPTG在37℃下诱导4h,重组蛋白主要以包涵体形式出现。

青稞4-香豆酸辅酶A连接酶基因4CL的克隆及表达分析

为了进一步了解4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase;4CL)基因在黄酮合成中的作用,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得了青稞4CL基因(Hv4CL)的cDNA全长序列,并利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术,对该基因在青稞4个胚乳发育时间段茎、叶和花中的表达情况进行研究。结果表明,Hv4CL基因cDNA序列全长2 107bp,该序列包含一个完整的开放阅读框(ORF,1 662bp),编码553个氨基酸。Hv4CL与小麦同源性最高(96%),且该蛋白序列中包含2个保守的box,即AMP结合盒:boxⅠ(SSGTTGLPKGV)和boxⅡ(GEICIRG)。qRT-PCR分析结果表明:4CL基因在青稞不同发育时期、不同组织的表达丰度不同,在茎中表达量最高,其次是叶和籽粒。

维管植物4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)研究进展

在大多数维管植物中4CL以基因家族形式出现。4CL基因成员在植物组织中差异表达,参与不同的苯丙烷类衍生物的生物合成。4CL基因的表达受发育调控,其表达还能被环境因子激活,如各种伤害、病原菌侵染、紫外线辐射等。4CL具有高度趋异的底物偏好性及底物特异性,决定4CL同工酶底物特异性的因素可能是结合沟的空间限制而不是底物和多肽链之间的特异性相互作用。在4CL氨基酸序列中存在2个保守的肽基序(motif),肽基序BoxⅠ,SSGTTGLPKGV,肽基序BoxⅡ,GEICIRG。应用反义技术已经成功地将4CL基因用于调控模式植物拟南芥、烟草及木本植物美洲山杨、毛白杨木质素的生物合成。未来的研究应侧重以下方向:应用多种技术分离、鉴定出更多木本植物的4CL基因;通过生物技术来增加木本植物木质素含量的研究也值得期待;建立4CL蛋白结晶体系,从原子水平解析4CL蛋白的结构,从而从根本上阐明4CL蛋白结构与功能之间的关系。

毛白杨4-香豆酸：辅酶A连接酶(4CL3)的酶学特征研究

为了进一步研究杨树4CL基因,以毛白杨为材料克隆到一个新的毛白杨4CL3基因。生物信息学分析结果显示:该基因和其他4CL基因一样含有4CL基因家族2个保守框Box I和Box II。将4CL3基因连接至原核表达载体pQE30,表达纯化后测定其蛋白的比活力,结果显示:4CL3基因对不同底物表现出了不同的催化效率。对该基因的最适温度和最适pH值测定后发现:4CL蛋白的最适温度为40℃,最适pH值为8.5,且在pH=9.0时有60%的活力。采用HPLC-MS的方法,分析了4CL3蛋白对混合底物的催化情况,结果显示:在混合底物下,4CL3蛋白对4-香豆酸、阿魏酸和肉桂酸都表现较高的活力,而对芥子酸和咖啡酸没有活力。

苦荞4-香豆酸辅酶A连接酶基因(Ft4CL)的克隆及序列分析

以苦荞栽培种‘西荞2号’为材料,利用同源克隆和RT-PCR技术获得Ft4CL保守片段,采用RACE技术获得Ft4CL基因的3'末端及5'末端序列,并进一步采用生物信息学方法进行序列分析。结果表明:从苦荞花蕾总RNA中获得一条苦荞麦(Fagopyrum tatarium)4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4-coumarate:Coa ligase,Ft4CL)的cDNA全长序列。生物息学分析结果显示,Ft4CL基因ORF全长1 602 bp,可编码553个氨基酸,理论标准分子质量为58.02kDa,等电点(pI)为5.23。该研究首次从苦荞中获得Ft4CL基因的cDNA全长序列,该基因具有植物4CL同源基因的典型特征,推导的氨基酸序列具有4CL的所有活性位点并归属于黄酮代谢支路。该研究结果可为深入研究苦荞黄酮代谢途径奠定基础,为采用代谢工程技术提高苦荞黄酮含量提供候选靶基因。

甘薯4-香豆酸辅酶A连接酶基因的生物信息学鉴定和表达分析

4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase,4CL)在苯丙烷类代谢途径中具有重要调控作用。该研究利用转录组数据在甘薯品种QS48中鉴定了11个4CL基因,并将这些基因命名为Ib4CL1~Ib4CL11。序列比对和功能域分析发现,11个Ib4CL蛋白均具有典型的4CL结构特征,包含保守的BoxⅠ和BoxⅡ的结构域。进化和保守基序分析显示,Ib4CL1和Ib4CL2属于Ⅰ类4CL,Ib4CL3属于Ⅱ类4CL,而Ib4CL4~Ib4CL11属于4CL类似蛋白。转录组数据和荧光定量PCR分析显示,Ib4CL3和Ib4CL10在甘薯QS48的叶中转录表达水平显著高于茎和块根,与绿原酸的积累呈正相关关系;Ib4CL4和Ib4CL8在嫩叶中表达较高,与花青素的积累密切相关。研究结果为进一步揭示甘薯4CL基因在苯丙烷类代谢途径中的功能奠定了基础。

毛白杨4-香豆酸:辅酶A连接酶可溶性原核表达及活性检测

为了进一步研究毛白杨4CL1的酶学特性，构建了毛白杨4CL1原核表达载体pQE31-4CL1．经IPTG诱导在大肠杆菌中表达了毛白杨4CL1蛋白，SDS-PAGE电泳分析表明该新蛋白的分子量为60kD，与预测值一致．对毛白杨4CL1蛋白在大肠杆菌中的表达体系进行了优化，确定IPTG的最佳浓度为0．4mmol／L，诱导时的菌液密度OD600为0．3-0．5，最佳表达时间为2h．37℃下表达的4CL1融合蛋白以包涵体的形式存在，没有生物学活性．当表达温度从37℃降低为28℃时，可溶性的有生物学活性的毛白杨4CL1蛋白诱导表达获得成功，表达量达11％．以耦联有Ni^2＋-NTA的琼脂糖为亲和层析填料，金属鳌合亲和柱层析一步纯化获得了电泳纯4CL1蛋白，4CL1蛋白对5种底物的比活性分别为：4-香豆酸3949．0pkat／mg，咖啡酸2214．0pkat／mg，阿魏酸715．0pkat／mg，肉桂酸84．9pkat／mg，而对芥子酸没有生物活性．

对-香豆酸与人血清白蛋白相互作用的荧光和表面增强拉曼光谱研究

在模拟生理条件下,应用荧光光谱和表面增强拉曼光谱法对对-香豆酸（p-CA）与人血清白蛋白（HSA）的结合机理进行研究。结果表明,p-CA对HSA的荧光猝灭机制为静态猝灭,并伴有非辐射能量转移。荧光光谱显示,在298,304,310 K下,p-CA与HSA的结合常数（KA）分别为3.41×10~4,2.09×10~4,1.38×10~4L/mol,结合位点数（n）近似为1。表面增强拉曼光谱研究揭示,p-CA的酚基与HSA有效结合。标记竞争实验指出,p-CA在HSA上的结合位点主要在SiteⅠ。反应过程热力学参数表明,二者间的作用主要为静电引力,且根据Frster能量转移理论求得p-CA与HSA间的距离为5.11 nm。同步荧光光谱显示,p-CA的结合没有导致HSA构象发生明显变化。

对-香豆酸和绿原酸对美拉德反应体系中5-羟甲基糠醛形成的影响

以谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸、半胱氨酸分别与葡萄糖反应构建美拉德反应体系,研究5-羟甲基糠醛(5-HMF)的形成量随时间的变化规律及对-香豆酸和绿原酸对5-HMF形成量的影响。结果表明:在相同反应时间内,模拟体系中5-HMF形成量由高到低排列依次是:谷氨酸-葡萄糖模拟体系>赖氨酸-葡萄糖模拟体系>甘氨酸-葡萄糖模拟体系>半胱氨酸-葡萄糖模拟体系;对-香豆酸、绿原酸对美拉德反应中5-HMF形成均表现出抑制和促进的"双重作用";不同质量浓度的对-香豆酸、绿原酸对5-HMF的影响趋势不同,相同质量浓度的同种酚酸对不同模拟反应体系中5-HMF的影响也有差异。

高效液相色谱法测定菟丝子中对-香豆酸含量

目的用高效液相色谱法测定菟丝子中对-香豆酸的含量。方法采用HypersilC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),流动相:乙腈-0.1%冰醋酸水溶液(25∶75),流速:1.0mL.m in-1,检测波长:308nm。结果对-香豆酸在2.0~40.0μg.mL-1浓度范围内线性关系良好,r=0.9993,平均回收率为99.9%,RSD为1.9%。结论本法简便、准确,可用于菟丝子中对-香豆酸的含量测定。

4-香豆酸辅酶A连接酶响应大豆孢囊线虫胁迫的潜在功能

大豆孢囊线虫是大豆产区病虫害防治策略的重要目标之一,大豆孢囊线虫的防控也一直是线虫领域研究热点之一。大豆孢囊线虫侵染不仅会造成大豆地下部分损伤,也使得地上部分受损从而影响其产量,因此需对大豆孢囊线虫的抗性机制进行分析以达到防控的目的。大豆孢囊线虫成功寄生宿主植物需对其细胞壁进行降解融合,形成为其生长发育提供唯一营养来源的合胞体。而阻碍大豆孢囊线虫移动和合胞体建立的细胞壁抗性是大豆抵御大豆孢囊线虫的关键,其中木质素是细胞壁发挥抗性的重要成分。木质素的生物合成主要包括莽草酸代谢途径、苯丙烷代谢途径和木质素合成的特异途径,4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate-Coenzyme A ligase,4CL)作为连接苯丙烷代谢途径和木质素特异合成途径的重要转折酶,决定了木质素的合成,其很可能是响应大豆孢囊线虫胁迫的重要调控因子。本文从线虫入侵需要细胞壁降解融合建立合胞体出发,围绕木质素导致的细胞壁抗性展开讨论,分析了4CL在细胞壁抗性中的响应机制,为进一步探索大豆孢囊线虫胁迫机制提供科学依据。

枇杷4-香豆酸CoA连接酶的某些特性

以枇杷品种‘解放钟’果实为试材,用硫酸铵分级盐析方法提取4-香豆酸CoA连接酶,其最适温度为10和40℃,40和10℃下的热稳定性较好;最适pH为8.0且较稳定;最适底物为咖啡酸。

比光谱-导数分光光度法同时测定对-香豆酸和阿魏酸

根据对-香豆酸和阿魏酸的紫外吸收特点,确立得到两种酚酸稳定的紫外吸收图谱的条件,建立比光谱-导数分光光度法,同时测定对-香豆酸和阿魏酸的含量。在溶剂为乙醇或水或乙醇与水的混合溶液时,调节溶液pH2.0,得到两种酚酸稳定的紫外吸收光谱图,最大吸收峰分别为对-香豆酸308nm、阿魏酸320nm。运用比光谱-导数分光光度法测定对-香豆酸和阿魏酸的二元混合物,回收率在93.40%～103.34%之间,结果良好。对蔗渣碱解提取的酚酸样品进行检测,阿魏酸检测受影响较大,而对-香豆酸检测结果较理想。本法对波谱严重重叠的两种酚酸能进行有效测定,

对-香豆酸、咖啡酸和绿原酸荧光特性的研究

以对-香豆酸、咖啡酸和绿原酸标准品为材料,研究溶液pH、溶剂、浓度对这三种酚酸荧光特性的影响。结果表明:影响它们荧光图谱的因素为pH和溶剂种类,随溶液碱性的增强其荧光峰均发生了明显的红移;这三种酚酸与溶剂(水、甲醇、二甲基亚砜)之间有明显的氢键效应,导致其荧光图谱不同:与水溶剂相比,当以甲醇或二甲基亚砜为溶剂时,其Stoke位移值均明显变小。影响这三种酚酸荧光强度的因素主要是pH和浓度,若以水为溶剂,对-香豆酸(λex/λem=350/440 nm)溶液在pH10、浓度为10 mg/L时的荧光强度最强;咖啡酸(λex/λem=385/465 nm)在pH8.5、浓度300 mg/L时的荧光强度达到最大值;绿原酸(λex/λem=380/490 nm)在pH11.5、浓度90 mg/L时的荧光强度最大。

重组毛白杨4-香豆酸:辅酶A连接酶的酶学性质研究

4-香豆酸：辅酶A连接酶（4CL）催化维管植物木质素生物合成羟基肉桂酸及其衍生物辅酶A酯化合物的形成。该文对我国乡土树种毛白杨重组Pt4CL1的酶学性质进行了初步研究,结果表明：Pt4CL1在高温下不稳定,10%甘油可部分提高其温度稳定性;Pt4CL1酶学反应最适温度为40℃;Pt4CL1在pH 3.0～8.0范围内比较稳定,当pH大于8.0时其Pt4CL1的稳定性下降;最适反应pH为8.0;Mg^2＋是Pt4CL1最适激活剂,EDTA可抑制其活性;Tris-HCl的最适浓度为0.2 mol/L;4-香豆酸是Pt4CL1的最适底物。