毛竹香豆酸-3-羟基化酶基因的克隆与表达研究

香豆酸-3羟-基化酶(C3H)是木质素单体合成中的一个关键酶。采用文库筛选的方法从毛竹萌发种子全长cDNA文库中克隆了1个C3H基因,命名为PheC3H。PheC3H基因全长1842bp,包括1个完整的开放阅读框,编码1个由513个氨基酸残基组成的蛋白(PheC3H),C端具有1个细胞色素P450蛋白(CYP450)特异的保守结构域。相似性比对显示,PheC3H与其他植物的C3H有着较高的相似性,其中与小麦的CYP98A蛋白相似性最高,达91.2%;聚类分析表明,PheC3H属于CYP98A亚家族蛋白;实时定量PCR结果表明,PheC3H在一年生实生毛竹叶鞘中表达量最高,其次是在根中,在叶片和茎中表达量相对较低。

3-(4-羟基苯基)丙酸在酿酒酵母中的生物合成

3-(4-羟基苯基)丙酸(HPPA)是一种芳香类化合物,作为中间体主要应用于医药、食品、化学领域,具有重要的经济价值。旨在实现HPPA在酿酒酵母中的从头合成,通过在酿酒酵母中过表达约氏黄杆菌来源的酪氨酸转移酶(Fj TAL)、拟南芥来源的对香豆酰辅酶A连接酶(At4CL),同时利用酿酒酵母BY4742自身来源的超长链烯酰辅酶A还原酶(Sc TSC13)、硫酯水解酶,实现了在酿酒酵母中从头合成HPPA,产量约为70 mg/L左右。在以4 mmol/L酪氨酸为前体、半乳糖诱导Fj TAL过表达、30℃发酵培养72 h的条件下,约36%的酪氨酸转化生成对香豆酸;在以4 mmol/L对香豆酸或咖啡酸为前体,半乳糖诱导At4CL过表达,同时利用酵母内源Sc TSC13、硫酯水解酶,30℃发酵培养72 h的条件下,约94%的对香豆酸被还原成HPPA,约91%的咖啡酸被还原成3,4-二羟基苯丙酸(DHPPA),为进一步生物合成HPPA及其衍生物奠定了基础。

木质素生物合成中羟基化酶的研究进展

介绍了3种调控木质素代谢的羟基化酶的遗传特性及其基因调控的研究进展,重点综述了香豆酸-3-羟基化酶(C3H)的最新研究进展,讨论了存在的问题并提出了相关策略。

木质素合成酶C3H基因的生物信息学分析

应用生物信息学的方法对GenBank中拟南芥、火炬松、胡麻、紫花罗兰等植物香豆酸-3-羟基化酶(c3h)基因以及本实验室克隆的欧美杨107的c3h基因(AM920690)核苷酸序列以及翻译的氨基酸序列的组成成分、导肽、跨膜结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二级结构及功能域等进行了初步分析预测。分析表明欧美杨107的C3H氨基酸序列不存在导肽,无跨膜结构域,肽链表现为亲水性;二级结构域与P450高度匹配,其高级结构中含有由含铁血红素和半胱氨酸组成的活性中心,并构建了c3h进化树,对其分子进化进行了探讨。

苯丙氨酸代谢途径关键酶:PAL、C4H、4CL研究新进展

主要阐述了苯丙氨酸代谢途径中三种关键酶:苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸4-羟基化酶(C4H)、4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)的研究进展,希望能为研究植物次生代谢途径的研究工作者提供一些帮助。

反义4CL与UGPase双价基因在烟草中的转化及表达分析

构建了携带紫穗槐尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,UGPase)基因和4-香豆酸:辅酶A连接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase,4CL)反义基因的双价基因植物表达载体,用热激法转化至根癌农杆菌LBA4404中,并用制备的农杆菌工程菌进行了烟草转化。PCR及Southern杂交结果证实,双价基因已成功整合到烟草基因组中。综纤维素和硫酸木质素含量测定结果显示,转基因烟草纤维素含量增加,木质素含量减少,表明双价基因能够有效表达。

木质素相关合成酶在甘蓝型黄、黑籽油菜中的表达差异

以1对甘蓝型黄籽(L2)、黑籽(L1)油菜的近等基因系为材料,研究了木质素生物合成的部分关键酶4CL、F5H和CAD在黄、黑籽油菜的不同组织中的表达差异。结果表明:4CL、F5H和CAD在甘蓝型黄、黑籽油菜不同器官和组织中的表达存在差异,特别是在种子中。其中,在同一组织器官中,4CL的不同种皮颜色之间的甘蓝型油菜中的表达差异明显;F5H在甘蓝型黄、黑籽油菜中的花与在30 d种子中的表达差异明显;CAD在种子的不同发育期中的表达差异明显。因此,这几种酶在甘蓝型黄、黑籽油菜种子中的表达差异,特别是在甘蓝型黄籽油菜的30 d种子中的表达都明显低于相应的黑籽油菜,说明这些酶的转录水平是导致木质素在甘蓝型黄、黑籽油菜之间存在表达差异的主要原因之一,也可能是形成甘蓝型黄、黑籽油菜皮壳差异的重要原因之一。

星宿菜的黄酮类化学成分

为了解星宿菜(Lysimachia fortunei Maxim.)的化学成分,利用溶剂萃取和色谱分离手段,从星宿菜全草的乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位分离得到了5个黄酮类化合物。经波谱分析及与文献数据对照,分别鉴定为:槲皮素(1)、异鼠李素-3-O-(6-香豆酸酯)-β-D-葡萄糖苷(2)、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷(3)、金丝桃苷(4)和山奈酚-3-O-[6-(3-羟基-3-甲基戊二酸单酯)]-β-D-葡萄糖苷(5),其中化合物2和5为首次从珍珠菜属植物中分离获得。

UGPase和反义4CL基因对转基因烟草纤维素和木质素合成的调控

用根癌农杆菌介导法将源于紫穗槐的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)基因、反义4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)基因以及两者的双价基因分别转移至烟草中。PCR和Southern杂交检测证实外源基因已整合到转基因烟草基因组中。测定全纤维素和Klason木质素含量的结果显示,增强UGPase基因的表达可提高转基因植株的纤维素含量,但对木质素含量没有影响;抑制4CL基因的表达可显著降低转基因植株的木质素含量,但对纤维素含量没有影响;转移双价基因的转基因植株中纤维素含量增加而木质素含量降低。

基于UPLC-Q/TOF-MS的中药水蜜丸制剂二至丸多成分稳定性研究

目的在遵循人用药品注册技术要求国际协调会(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use,ICH)制剂稳定性指导原则的指导下,在采用超高效液相色谱-飞行时间质谱(UPLC-Q/TOF-MS)联用技术对中药传统水蜜丸制剂二至丸进行多成分定性定量研究的基础上,进行二至丸长期稳定性和加速稳定性研究,并考察了制剂影响因素对制剂稳定性的影响。方法采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1mm,1.7μm),流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈,梯度洗脱,体积流量0.2 m L/min,采用电喷雾电离源(ESI),正、负离子模式扫描。在遵循ICH制剂稳定性指导原则的指导下,进行了18个月的长期稳定性试验[温度(25±2)℃,相对湿度(RH)(60±5)%],加速稳定性试验[温度(40±2)℃,RH(75±5)%]和制剂影响因素试验(包装材料类型和密封条件)。结果采用以上方法共鉴定出二至丸中20个化学成分(红景天苷、蟛蜞菊内酯、10-羟基木犀榄苷二甲酯、木犀榄苷-11甲酯、马钱苷酸、松果菊苷、女贞苦苷、橄榄苦苷酸、毛蕊花苷/异毛蕊花苷、女贞苷、特女贞苷、ligustroflavone、特女贞苷异构体、阿富汗丁香苷F、异女贞苷、女贞酸、橄榄苦苷、女贞苷-G13、青藤碱、3-O-顺式-对-香豆酰委陵菜酸),并对其进行定量及归一化半定量研究。在长期稳定性研究中,20个成分均保持稳定;然而在加速稳定性试验条件下,11种成分(10-羟基木犀榄苷二甲酯、松果菊苷、女贞苦苷、橄榄苦苷酸、毛蕊花苷、女贞苷、特女贞苷、ligustroflavone、女贞酸、女贞苷-G13、青藤碱)的量明显下降。制剂影响因素试验结果显示采用钠钙玻璃包装材料替代现有市售聚酯包装,在密封或敞口条件下,制剂中各成分稳定性均显著提高。在采用相同包材时密封条件对制剂稳定性也存在显著性影响。结论通过较为系统的中药传统口服制剂类型水蜜丸的制剂稳定性研究,为中药制剂质量控制水平和临床用药安全提供技术支持。

大果榕茎化学成分研究

目的 研究大果榕Ficus auriculata茎的化学成分。方法 运用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱，以及制备薄层色谱等方法分离纯化，通过波谱数据和理化性质鉴定结构。结果 从大果榕茎95%乙醇提取物中分离得到14个化合物，分别鉴定为6β-羟基豆甾-4-烯-3-酮（1）、6α-羟基豆甾-4-烯-3-酮（2）、豆甾-4-烯-3-酮（3）、3β-羟基豆甾-5-烯-7-酮（4）、豆甾-4-烯-3, 6-二酮（5）、麦角甾醇过氧化物（6）、（20S）-3-oxo-20-hydroxytaraxastane（7）、伞形香青酰胺（8）、金色胡椒酰胺乙酸酯（9）、palmarumycin BG1（10）、7-羰基-脱氢枞酸（11）、松柏醛（12）、S-（＋）-dehydrovomifoliol（13）、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸（14）。结论 化合物2、5、7～13为首次从该属植物中分离得到，所有化合物均为首次从该植物中分离得到。

大花益母草的化学成分研究

目的研究大花益母草Leonurus macranthus的化学成分。方法采用硅胶、Sephadex LH-20、ODS柱色谱和半制备HPLC等色谱技术进行分离纯化,并根据理化性质和波谱数据鉴定化合物的结构。结果从大花益母草地上部分70%丙酮提取物的二氯甲烷萃取部位分离鉴定了19个化合物,分别鉴定为(+)-丁香脂素(1)、(+)-1-羟基丁香脂素(2)、rayalinol(3)、erythro-guaiacylglycerol-β-O-4′-coniferyl ether(4)、(7R,7′R,7″S,8S,8′S,8″S)-3′,4″-dihydroxy-3,5,4′,5″-tetramethoxy-7,9′:7′,9-diepoxy-4,8″-oxy-8,8′-sesquineo-lignan-7″,9″-diol(5)、(7R,7′R,7″S,8S,8′S,8″S)-4′,5″-dihydroxy-3,5,3′,4″-tetramethoxy-7,9′:7′,9-diepoxy-4,8″-oxy-8,8′-sesquineo-lignan-7″,9″-diol(6)、芫花素(7)、3′-羟基芫花素(8)、圣草酚(9)、异莨菪亭(10)、对香豆酸(11)、咖啡酸甲酯(12)、反式-阿魏酸(13)、丁香醛(14)、香草酸(15)、oct-1-en-3-ylβ-glucopyranoside(16)、5-羟基-2-吡咯烷酮(17)、pterolactam(18)和烟酰胺(19)。结论化合物1~6和9~19为首次从益母草属植物中分离得到,化合物7和8为首次从大花益母草中分离得到。

竹根化学成分的研究(Ⅱ)

目的研究竹根的化学成分。方法采用色谱方法分离化学成分,根据波谱数据及理化常数分析进行结构鉴定。结果分离鉴定了9个化合物,分别为3-(p-羟基苯)-(2,3)环氧-1-丙酸(Ⅰ)、2,3-二羟基-1-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-1-丙酮(Ⅱ)、(+)-鹅掌揪树脂醇B(Ⅲ)、原儿茶醛(Ⅳ)、原儿茶酸(Ⅴ)、荭草苷(Ⅵ)、牡荆苷(Ⅶ)、异荭草苷(Ⅷ)、异牡荆苷(Ⅸ)。结论化合物Ⅰ为新化合物,命名为环氧香豆酸(epoxy coumaric acid)。

栀子中2个成分的分离鉴定及不同采收期栀子样品的比较分析

目的：分离制备栀子药材中化学成分,建立栀子中该成分HPLC含量测定法.方法：色谱条件采用Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250mm,5μm）,以乙腈-0.1％磷酸水溶液（18∶82）为流动相,流速1.0 mL·min-1,检测波长327 nm,柱温40℃.结果：从栀子药材中分离鉴定出6＂-对香豆酰京尼平龙胆双糖苷（1）,3,5-二-O-咖啡酰基-4-O-（3-羟基-3-甲基）戊二酰基奎宁酸（2）2个成分;这2个成分在0.118 8～1.188,0.122 8 ～1.228 μg线性关系良好;平均回收率分别为99.23％,100.4％,RSD分别为2.4％,2.3％;栀子不同采收期对2种成分含量影响较大.结论：本试验结果能较好地反映栀子不同采收期成分的变化,可为栀子药材质量标准的完善提供参考.