马γ-干扰素成熟蛋白基因在大肠埃希氏菌中表达及其多克隆抗体制备

采用RT-PCR从ConA刺激的马外周血单核细胞(PBMC)中扩增获得含信号肽的马γ-干扰素(Equine interferon-γ,EIFN-γ)基因,将其克隆至载体pCR2.1-TOPO中。通过PCR方法从重组质粒(pCR-EIFN-γ)中扩增马干扰素成熟蛋白(Mature EIFN-γ,reEIFN-γ)基因,并将其亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)。重组子经测序鉴定正确后转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,对其产物进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,将纯化后的表达产物免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。结果表明,mEIFN-γ基因全长为441bD,含一个开放阅读框,编码146个氨基酸的成熟蛋白;对其表达产物以可溶性和包涵体两种形式存在,重组蛋白相对分子量约为18Ku,且具有免疫反应活性。mEIFN-γ基因在大肠杆菌中高效表达并在非变性和变性条件下,采用Ni^+亲和层析纯化方法均可获得高纯度的重组马γ-干扰素制备的多克隆抗体,为建立马γ-干扰素检测方法、监测机体免疫状态和研究机体免疫机制奠定了基础。

重组马γ-干扰素抗病毒活性测定及单克隆抗体抑制活性鉴定

为了测定大肠杆菌和杆状病毒表达的重组马γ-干扰素是否具有抗病毒活性,利用这两种干扰素处理马胎肾细胞(EFK-78),然后接种表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组水泡性口炎病毒(VSV*GFP),观察干扰素对病毒表达GFP的抑制,测出其抗病毒活性单位分别为1×103AU/mL、1×105AU/mL。评价了制备的九株抗重组马γ-干扰素单克隆抗体是否可抑制重组马γ-干扰素抗病毒活性,证实其中一株可中和重组马γ-干扰素的抗病毒活性。结果表明:杆状病毒表达的马γ-干扰素具有较高的抗病毒活性,其活性可被一株制备的抗重组马γ-干扰素单克隆抗体抑制;首次获得原核表达的具有抗病毒活性的马γ-干扰素。

马γ-干扰素双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的:建立检测马γ-干扰素的双抗体夹心ELISA,为马传染病的免疫学研究提供新方法。方法:将识别不同表位的抗马γ-干扰素的2株单克隆抗体(mAb,A5和SB10)纯化后,利用生物素标记试剂盒对其中1株纯化的mAb(SB10)进行标记,通过对重组马IFN-γ进行ELISA检测来建立马γ-干扰素双抗体夹心ELISA。结果:经过方阵滴定实验确定捕获抗体的最佳浓度为1mg/L,检测抗体的工作效价为1∶1000。利用建立的方法对不同稀释度的重组马γ-干扰素和丝裂原刺激的马外周血单核细胞培养上清进行检测。结论:此方法检测敏感度达到1μg/L,特异性良好,为马的细胞免疫学研究提供了方法,并为建立马γ-干扰素ELISPOT检测方法奠定了基础。