P-糖蛋白高表达马丁达比狗肾上皮细胞系的建立

目的为建立能稳定表达人P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的马丁达比狗肾上皮(Madin-Darby canine kidney,MDCK)细胞转基因细胞系,并鉴定其是否适用于药物转运实验。方法将质粒pcDNA3.1(+)/MDR1通过LipofectamineTM2000转染试剂转染犬肾上皮细胞MDCK,经G418筛选获得抗性克隆。通过P-gp的荧光底物罗丹明(Rhodamine123,Rho123)在各单克隆细胞内的积聚量以及维拉帕米存在时细胞内积聚量检测P-gp的活性。反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Westernblot)检测人源多药耐药基因1(multidrug resistance1,MDR1)的mRNA和P-gp表达量。应用筛选出的MDCK-MDR1单克隆细胞株,研究了Rho123在MDCK和MDCK-MDR1(Madin-Darby canine kidney/multidrug resistance1)细胞中的转运及4种经典抑制剂(维拉帕米、环孢素、酮康唑和奎宁)对Rho123转运的抑制特性。结果RT-PCR和Western blot检测表明,所建立的MDCK-MDR1细胞与MDCK细胞相比,经转染后MDCK细胞内的MDR1的信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)和P-gp表达发生从无到有的变化。Rho123在MDCK和MDCK-MDR1中的外排系数分别是5.94和15.45,抑制剂能显著地抑制细胞外排作用。结论转染后的细胞高表达P-gp,适用于研究药物的肠道和血脑屏障转运实验。

基于马丁达比犬肾上皮细胞单层模型研究去氢骆驼蓬碱吸收转运特性

目的研究去氢骆驼蓬碱(harmine,HM)在马丁达比犬肾上皮(Madin Darby canine kidney,MDCK)细胞模型上的吸收转运特性。方法用噻唑蓝比色法考察HM对MDCK细胞的毒性。建立MDCK细胞单层模型,通过检测跨膜电阻以确定细胞单层的完整性和致密性。建立细胞渗透液中HM的高效液相色谱测定方法,考察不同方向、浓度、时间及P-糖蛋白抑制药(维拉帕米、环孢素A)对HM吸收的影响,计算药物累计透过量(cumulative permeation volume,Q)、表观渗透系数(apparent permeability coefficient,P_(app))及外排比(efflux ratio,ER)。结果HM在0.93~7.46μg·mL^(-1)内对MDCK细胞无毒性作用。MDCK细胞培养至5 d时电阻值大于600Ω·cm^(2),表明细胞单层模型建立成功。HM在MDCK细胞单层模型上Q具有浓度和时间依赖性。在低、中、高质量浓度下P_(app)分别为(1.97±0.09)×10^(-5),(2.02±0.18)×10^(-5)和(2.31±0.16)×10^(-5)cm·s^(-1)。双向转运结果显示,低、中、高质量浓度下HM分泌方向的P_(app)显著大于吸收方向的P_(app),ER为2.57。加入P-糖蛋白抑制药后,HM吸收方向的P_(app)显著增加。结论HM属于吸收良好的药物,其转运机制以被动吸收为主,同时兼有P-糖蛋白等外排体参与其转运过程。

人寡肽转运体1转染MDCK细胞与转染HeLa细胞的比较研究

目的筛选出更适宜的转染受体细胞,提高构建人寡肽转运体1(human peptide transporter 1,hPepT1)高表达细胞系的效率。方法利用Lipofectamine^(TM) 2000转染试剂将pcDNA3.1(+)-hPepT1质粒分别转染进MDCK细胞与HeLa细胞,并进行单克隆细胞的挑选和扩大培养。通过qRT-PCR与Western blot技术来检测两种受体细胞中hPepT1 mRNA与蛋白的表达水平,并利用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)对两种单克隆转染细胞的hPepT1典型底物甘氨酰肌氨酸(Glysar)摄取能力进行考察。结果 MDCK细胞与HeLa细胞转染后,hPepT1 mRNA与蛋白表达水平以及Glysar的摄取能力均明显高于其野生型细胞(P<0.05);虽然Glysar在HeLa细胞中的摄取量高于MDCK细胞,但MDCK-hPepT1细胞中hPepT1 mRNA与蛋白表达水平以及Glysar的摄取能力却高于HeLa-hPepT1细胞。结论在hPepT1稳定高表达转染细胞模型的构建中,为提高hPepT1的转染效率,从而获得更高效的转染细胞模型,以MDCK细胞作为转染的受体细胞可能是更为适宜的选择。

热加工降低板蓝根对狗肾上皮细胞的毒性

调查不同热加工阶段板蓝根样品对狗肾上皮细胞的毒性.选用常用于流感病毒检测和抗流感药物的狗肾上皮细胞作实验模型,采用MTT比色法研究菘蓝新鲜根、板蓝根、板蓝根煎剂三种样品对MDCK细胞的细胞毒性情况.结果显示:菘蓝新鲜根、板蓝根和板蓝根煎剂三种样品的细胞半数致死浓度分别为3.74、39.55和61.95 mg·mL-1.该结果表明,热加工可降低板蓝根对狗肾上皮细胞的细胞毒性,这可能与热加工过程中发生的美拉德反应相关.

稳定表达人有机阳离子转运体1的细胞模型构建

目的建立能稳定表达人有机阳离子转运体1(human organic cation transporter1,hOCT1)野生型及两个突变体的马丁达比狗肾上皮(Madin-Darby canine kidney,MDCK)细胞模型。方法从人肝组织中提取hOCT1野生型基因,经定点突变获得hOCT1P341L,hOCT1M420del两个突变型基因,构建表达质粒pcDNA3.1(+)-hOCT1,pcDNA3.1(+)-hOCT1P341L,pcDNA3.1(+)-hOCT1M420del。将质粒转染MDCK细胞,通过G418筛选获得抗性克隆,并通过hOCT1的荧光底物(4-二甲氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶(ASP+)筛选得到具有较高活性的MDCK-hOCT1细胞。经反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及经典底物N-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)的摄取实验,鉴定筛选得到的单克隆细胞株hOCT1 mRNA的表达及功能。结果本实验获得的hOCT1野生型及2个突变体细胞模型与转染空载体的MDCK细胞相比,其hOCT1 mRNA表达量显著增高,对经典底物MPP+的摄取为转染空载体细胞的12.5,13.7,12.0倍,hOCT1抑制剂可显著抑制细胞对MPP+的摄取。结论建立的细胞模型可用于hOCT1抑制剂及底物的筛选。

稳定表达人寡肽转运体1的细胞模型构建及应用

目的构建稳定表达人寡肽转运体1(hPepT1)的马丁-达比犬肾细胞模型(MDCK-hPepT1),并将其应用于中药单体中人寡肽转运体1抑制剂的筛选。方法构建重组质粒pcDNA3.1(+)-hPepT1,将其转染马丁-达比犬肾系细胞,经G418筛选后以有限稀释法挑选单克隆细胞。以人寡肽转运体1荧光底物β-Ala-Lys(AMCA)和经典底物Glysar对单克隆细胞转运活性进行验证;通过反转录聚合酶链式反应验证人寡肽转运体1在转录水平的表达。以中药单体对Glysar摄取的影响实现人寡肽转运体1抑制剂的筛选。结果获得的两株单克隆细胞(D19、A11)对β-Ala-Lys(AMCA)摄取均显著高于转染空载体的马丁-达比犬肾系细胞,对Glysar的摄取分别为转染空载体细胞的24、11倍;D19、A11中hPepT1的mRNA水平亦显著高于转染空载体的细胞;已知的人寡肽转运体1抑制剂(底物)显著减少单克隆细胞D19和A11对Glysar的摄取;部分中药单体对Glysar摄取产生不同程度的抑制。结论本实验成功构建了稳定高表达人寡肽转运体1的马丁-达比犬肾系细胞模型,并应用该模型筛选出对人寡肽转运体1具有潜在抑制作用的中药单体。

黄诺马苷在MDCK单层细胞模型上的转运机制分析

目的:研究黄诺马苷在马丁达比犬肾上皮(MDCK)单层细胞模型上的吸收转运特性。方法:利用噻唑蓝(MTT)比色法考察黄诺马苷对MDCK细胞的毒性,使用Millicell-ERS-2型细胞电阻仪检测MDCK单层细胞模型的电阻值,考察黄诺马苷的质量浓度、给药时间以及钠-葡萄糖协同转运蛋白(SGLTs)抑制剂和葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)抑制剂对其跨膜转运的影响,采用UPLC-MS/MS测定黄诺马苷的含量,计算表观渗透系数(Papp)及外排比(ER)。结果:黄诺马苷质量浓度为5. 625~120 mg·L-1时对MDCK细胞无明显毒性作用,黄诺马苷在MDCK单层细胞模型上的转运具有时间、浓度依赖性,且Papp基本处于1×10-6~10×10-6cm·s-1。在60 min和90 min时,与空白组相比,根皮苷组中黄诺马苷在MDCK单层细胞模型上的转运量显著减少。结论:黄诺马苷在肠道中属于中等吸收的药物,其跨膜转运机制以被动转运为主,兼有主动转运存在,且SGLTs转运体可能参与介导了黄诺马苷在MDCK单层细胞模型上的转运。

有机阴离子转运体1抑制剂筛选模型的构建及应用

目的建立能稳定表达有机阴离子转运体1(organic anion transporter,OAT1)的马丁达比狗肾上皮(Madin-Darby canine kidney,MDCK)细胞转基因细胞模型,利用该模型初步筛选OAT1的抑制剂。方法采用脂质体转染法将质粒pcDNA3.1(+)通过Lipofectamine^(TM)2000转染试剂转染MDCK细胞,并经G418筛选获得阳性克隆。通过OAT1的经典底物6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein,6-CFL)在单克隆细胞内的积聚量以及中药单体存在时细胞内的积聚量来检测OAT1的活性。实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-tinle PCR)检测OAT1的mRNA的表达量。利用稳定细胞株,研究了6-CFL在MDCK-mock和MDCK-OAT1细胞中的摄取、中药单体对6-CFL摄取的抑制特性。结果 qRT-PCR结果表明,所建立的MDCK-OAT1细胞与mock细胞相比,OAT1 mRNA相对表达量为后者的4 862倍,摄取6-CFL的能力为后者的14.9倍。6-CFL在细胞株中摄取的K_m值为42.36μmol·L^(-1),部分中药单体能显著抑制MDCK-OAT1转运6-CFL的能力。结论 OAT1抑制剂筛选模型构建成功,并能快速有效地筛选出对OAT1有潜在抑制作用的中药单体,为后期的基于OAT1的植物-药物相互作用提供实验基础。

2013—2014年连云港市流感病毒分离结果分析

目的对2013—2014年度连云港市流行性感冒的病原学监测结果进行分析,了解连云港市流感流行动态,探索流行规律,为流感防治提供科学依据。方法采集流感样病例(ILI)的鼻咽拭子标本,用狗肾细胞(MDCK)进行病毒分离,采用血凝抑制方法(HI)进行流感病毒型别鉴定。结果 2013年4月—2014年3月共检测流感哨点医院ILI鼻咽拭子标本970份,分离到流感病毒44株,阳性分离率为4.54%,经分型鉴定新甲H1N1亚型35株(79.55%),A型H3亚型5株(11.36%),B型Yamagata亚型4株(9.10%)。结论 2013年流行的优势毒株为新甲H1N1亚型,2014年流行的优势毒株为B型Yamagata亚型,每年的3、4月份会出现流感亚型的转变。

连翘苷经血脑屏障体外透过机制研究

目的：研究连翘苷经血脑屏障的体外透过机制。方法：以0（阴性对照）、10、25、50、75、100μg/ml连翘苷溶液培养大肠癌MDR1基因转染的马丁达比犬肾上皮（MDCK-MDR1）细胞24 h,刃天青法检测细胞活力并计算细胞生存率。以10、25、50、75、100μg/ml连翘苷溶液培养MDCK-MDR1细胞10 min后,检测胞内连翘苷含量并绘制质量浓度-摄取速率曲线;0（阴性对照）、50、100μg/ml连翘苷溶液培养MDCK-MDR1细胞3 h后,倒置荧光显微镜下观察细胞紧密连接蛋白结构。结果：与阴性对照比较,10~100μg/ml连翘苷溶液培养细胞24 h后细胞存活率无明显改变。在10~100μg/ml质量浓度范围内,MDCK-MDR1细胞摄取速率与连翘苷的质量浓度不呈线性关系,有逐渐饱和趋势。50、100μg/ml连翘苷溶液培养细胞3 h后,细胞紧密联接蛋白完整。结论：在透过模拟血脑屏障时,连翘苷的吸收可能为被动转运结合主动转运,其质量浓度对细胞紧密联接蛋白有影响。

热加工对板蓝根体外抗A型流感病毒活性的影响

目的调查热加工对板蓝根体外抗A型流感病毒活性的影响。方法采用A型流感病毒侵染后的狗肾上皮细胞作为板蓝根抗病毒活性的评价模型,测定菘蓝新鲜根冷抽提液、菘蓝新鲜根煎剂、板蓝根冷抽提液和板蓝根煎剂对A型流感病毒的半数抑制率和治疗指数。结果除菘蓝新鲜根冷抽提液对A型流感病毒的半数抑制率和治疗指数无法测得外,菘蓝新鲜根煎剂、板蓝根冷抽提液和板蓝根煎剂对的A型流感病毒的半数抑制率和治疗指数分别为:0.65 mg/ml,0.46mg/ml,1.12 mg/ml和10.72、8.49和14.02。结论热加工可提高板蓝根抗A型流感病毒的治疗指数,这可能与热加工过程中发生的美拉德反应相关。

麻杏石甘汤及汤剂中聚集物体外对A型流感病毒活性的影响

目的:探讨麻杏石甘汤以及汤剂中聚集物体外对A型流感病毒活性的影响。方法:运用狗肾上皮(MDCK)细胞培养、MTT比色法检测7 200r/min离心上清经0.45μm膜过滤前后麻杏石甘汤蒸馏水煎剂样品体外对A型流感病毒活性变化;运用动态光散射粒度分析仪、场发射扫描电子显微镜分析过滤前后麻杏石甘汤以及聚集物的粒径及形貌特征。结果:麻杏石甘汤0.45μm膜过滤前后,对流感病毒感染MDCK细胞治疗指数(TI)分别为:3.65,0.27,膜过滤明显降低了滤过液的抗病毒活性;动态光散射测定结果表明,膜过滤去除了大量粒径较大的聚集物,明显缩小了体系的粒径分布范围,过滤后,体系平均粒径下降约70.00nm;电镜观察表明,粒径>500.00nm的聚集物多截留于膜上。结论:麻杏石甘汤体外抗A型流感病毒活性与其汤剂中聚集物具有相关性。