马兜铃酸Ⅰ及马兜铃内酰胺Ⅰ对肾小管上皮细胞损伤的差异

目的 :初步探讨马兜铃酸Ⅰ (AA Ⅰ )及马兜铃内酰胺Ⅰ (AL Ⅰ )导致肾小管上皮细胞损伤的机制。方法 :以体外培养的人近端肾小管上皮细胞系 (HK 2 )为研究对象 ,分别以不同浓度的AA Ⅰ (2 .5mg/L)与AL Ⅰ (5mg/L) 刺激细胞 ,以流式细胞仪分析细胞DNA含量以了解细胞凋亡情况 ;采用ELISA法检测细胞培养上清液中纤连蛋白 (FN)及转化生长因子 β1 (TGF β1 )分泌水平 ;分别用特异性抗TGF β1中和抗体阻断TGF β1作用后 ,观察AA Ⅰ与AL Ⅰ诱导细胞凋亡及FN分泌的改变。结果 :与对照组相比 ,AA Ⅰ刺激 1 2h后HK 2细胞的TGF β1分泌水平显著增高 ,36h后FN分泌水平明显增加 ,4 8h后HK 2细胞凋亡显著增多 ,抗TGF β1中和抗体 (5mg/L)能够抑制AA Ⅰ诱导的HK 2细胞凋亡 (抑制率达 6 3.7% ,P <0 .0 0 1 )及FN分泌 (抑制率 5 0 .2 % ,P <0 .0 0 1 )。与AA Ⅰ有所不同 ,AL Ⅰ刺激HK 2细胞后仅在 4 8h同时诱导TGF β1、FN分泌 ,并导致细胞凋亡 ,而抗TGF β1中和抗体 (5mg/L)却不能阻断AL Ⅰ引起的相应改变。 结论 :AA Ⅰ导致肾小管上皮细胞凋亡和FN分泌的作用可能是由TGF β1所介导的。尽管AL Ⅰ与AA Ⅰ同样具有导致细胞凋亡以及细胞外基质成分分泌的作用 ,但AL Ⅰ的作用机制有别于AA Ⅰ ,可能通过非TGF β1机制而发挥?

液质联用法测定十一味参芪片中马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅳa和马兜铃内酰胺Ⅰ

目的:建立十一味参芪片中马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅳa和马兜铃内酰胺Ⅰ的液相色谱-质谱法(LCMS)检测分析方法。方法:Kromasil Proshell C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,2.5μm),以乙腈-0.1%乙酸水溶液(含10 mmol·L^(-1)乙酸铵)为流动相,梯度洗脱,流速0.3 mL·min^(-1);多反应监测模式,马兜铃酸Ⅰ为m/z 359.1→298.1(定量)和m/z 359.1→296.1(定性),马兜铃酸Ⅳa为m/z 375.1→312.2(定量)和m/z 375.1→297.2(定性),马兜铃内酰胺Ⅰ为m/z 294.1→279.0(定量)和m/z 294.1→251.1(定性),建立十一味参芪片中3个马兜铃酸类成分的LC-MS,在方法学验证的基础上对所有样品进行检测分析。结果:马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅳa和马兜铃内酰胺Ⅰ进样量分别在2.0197~100.9829、1.9478~116.8656、1.9718~98.5880 pg时线性关系良好(r>0.999),定量限分别为1、6、2 pg,加样回收率分别为92.95%(RSD为2.28%)、80.09%(RSD为4.16%)、104.89%(RSD为3.24%)。14批十一味参芪片样品中马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅳa和马兜铃内酰胺Ⅰ的检出量分别为21.0~47.6、185.0~506.1、164.4~426.0 ng·g^(-1)。结论:所建立的方法快速、准确、灵敏、可靠,能够用于十一味参芪片中上述马兜铃酸类成分的筛查与分析,可为其安全性有关成分研究提供参考。

液质联用法测定齿痛消炎灵颗粒中马兜铃酸Ⅰ和马兜铃内酰胺Ⅰ

目的:建立齿痛消炎灵颗粒中马兜铃酸Ⅰ和马兜铃内酰胺Ⅰ的液质联用检测分析方法。方法:采用Agilent SB-C_(18)(2.1 mm×50 mm,1.8μm)色谱柱,以乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相,梯度洗脱,流速0.3 mL·min^(-1);多反应监测模式,马兜铃酸Ⅰ为m/z 359.0→298.1(定量)和m/z 359.0→296.1(定性),马兜铃内酰胺Ⅰ为m/z 294.0→278.9(定量)和m/z 294.0→251.1(定性),建立齿痛消炎灵颗粒中2个马兜铃酸类成分的液质联用检测方法,在方法学验证的基础上对所有样品进行检测分析。结果:马兜铃酸Ⅰ和马兜铃内酰胺Ⅰ进样量分别在51.849~1036.984、1.842~36.848 pg范围内线性关系良好,R^(2)≥0.9995,定量限分别为26.91、0.69 pg,平均加样回收率分别为107.2%~107.4%(RSD 0.50%~2.1%)、98.9%~105.5%(RSD 1.3%~2.9%)。16批齿痛消炎灵颗粒样品中均未检出马兜铃酸Ⅰ,马兜铃内酰胺Ⅰ的检出量为0.063~0.763μg·g^(-1)。结论:所建立的方法准确、灵敏、可靠,能够用于齿痛消炎灵颗粒中上述马兜铃酸类成分的筛查与分析,为其安全性有关成分研究提供科学依据。

马兜铃内酰胺-Ⅰ进入人肾小管上皮细胞及细胞内分布和蓄积的观察

目的:观察马兜铃内酰胺-Ⅰ(AL-Ⅰ)能否进入肾小管上皮细胞及其在细胞内的分布、蓄积情况。方法:以体外培养的人类近端肾小管上皮细胞系(HK-2)为研究对象,用不同质量浓度的AL-Ⅰ(5～20μg.mL-1)处理细胞,采用荧光倒置显微镜观察细胞内由AL-Ⅰ产生荧光的有无及其分布,并在洗去含AL-Ⅰ的培养液后继续培养HK-2细胞48h,观察细胞内AL-Ⅰ荧光的持续情况以判断其蓄积性。结果:不同质量浓度的AL-Ⅰ(5～20μg.mL-1)处理细胞0.5h内,均能在肾小管上皮细胞内观察到蓝绿色的AL-Ⅰ荧光,并且荧光仅分布于细胞浆中,而在细胞核内未观察到。在洗去含AL-Ⅰ培养液后继续培养时AL-Ⅰ的荧光可在细胞内持续存在48h以上,其持续存在部位仍为细胞浆。结论:AL-Ⅰ可以在短时间内迅速进入肾小管上皮细胞,其分布部位在细胞浆,不进入细胞核;AL-Ⅰ在细胞浆内的蓄积可能与其致肾损伤的毒性作用机制有关,即通过进入肾细胞并蓄积于细胞内在肾病过程中持续发挥毒性作用。

马兜铃内酰胺I对肾小管上皮细胞的损伤作用

目的 :了解马兜铃内酰胺I(AL I)是否导致肾小管上皮细胞损伤。方法 :以体外细胞培养的人类近端肾小管上皮细胞系 (HK 2 )为研究对象 ,以马兜铃酸I(AA I)为阳性对照 ,采用LDH释放试验检测AL I的直接细胞损伤作用 ;用相差显微镜、电子显微镜观察细胞形态变化 ,用流式细胞仪分析细胞DNA含量以及细胞膜磷脂酰丝氨酸 (PS)表达水平 ,以了解细胞凋亡情况 ;采用ELISA法检测细胞培养上清液中细胞外基质成分纤连蛋白 (FN)以及促纤维化细胞因子转化生长因子 β1(TGFβ1)的分泌水平。 结果 :AL I(2 .5～ 2 0mg·L- 1)具有浓度依赖的直接细胞损伤作用 ;细胞形态、DNA含量及PS表达水平分析表明 ,AL I在上述浓度范围内能够导致HK 2细胞凋亡 ,并能够导致HK 2细胞分泌TGFβ1及FN。与AA I的作用进行比较发现 :在相同浓度情况下 ,AL I的直接细胞毒作用强于AA I,但其导致细胞凋亡、TGFβ1及FN分泌的能力弱于AA I。结论 :马兜铃酸的代谢产物AL I能够造成肾小管上皮细胞的损伤 ,作用与AA I相似。尽管其致损伤作用较AA I弱 ,但仍有可能是含马兜铃酸中药导致肾脏损伤及其纤维化过程的毒性成分之一。

马兜铃酸Ⅰ对大鼠五脏的毒性及功能影响

【目的】探究马兜铃酸Ⅰ(aristolochic acidⅠ,AA-Ⅰ)对大鼠五脏(心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏)的毒性及功能影响,为今后马兜铃属类中药临床用药提供参考。【方法】将SD大鼠随机分为AA-Ⅰ给药组和空白对照组,给药组按20 mg/kg灌服AA-Ⅰ,连续7 d。于给药后0.25、0.5、1、2、24 h及停药后15 d,采集大鼠五脏组织。利用HPLC法检测各个时间点五脏组织中的AA-Ⅰ及马兜铃内酰胺Ⅰ(aristolactams-Ⅰ,AL-Ⅰ)含量,并检测大鼠五脏主要生理功能及病理组织学变化。【结果】给药后0.25 h,AA-Ⅰ主要分布于心脏、肝脏、脾脏和肺脏,同时在肝脏和脾脏中检测到AL-Ⅰ;给药后0.5 h,AA-Ⅰ主要分布于心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏,除心脏外,其余四脏中AA-Ⅰ含量均达到高峰值,且在肝脏、肺脏、肾脏中检测到AL-Ⅰ;给药后1 h,AA-Ⅰ主要分布于肝脏和肺脏,且在肝脏中检测到AL-Ⅰ;给药后2 h,AA-Ⅰ主要分布于心脏、肝脏、肺脏和肾脏,且在肾脏中检测到AL-Ⅰ;给药后24 h,AA-Ⅰ主要分布于心脏和肝脏,且在肝脏中检测到AL-Ⅰ;停药后15 d,五脏中均未检测到AA-Ⅰ及AL-Ⅰ。功能检测结果显示,大鼠灌服AA-Ⅰ可引起五脏发生氧化应激损伤。【结论】连续7 d给大鼠灌服20 mg/kg AA-Ⅰ,在五脏中均可检测到不同含量的AA-Ⅰ,且在肝脏、肾脏、肺脏及脾脏中检测到AL-Ⅰ。AA-Ⅰ可对五脏造成不同程度的损伤,其损伤与氧化应激有关。

HPLC法同时测定马兜铃中4种成分

目的建立同时测定马兜铃Aristolochia debilis Sieb.et Zucc.中马兜铃酸III、7-羟基马兜铃酸Ⅰ、马兜铃内酰胺Ⅰ、马兜铃酸Ⅰ的HPLC方法。方法马兜铃70%甲醇提取液的分析采用Agilent Extend C18色谱柱（4.6 mm×250 mm,5μm）;流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）,梯度洗脱;体积流量1.0 mL/min;柱温30℃,检测波长254 nm。结合大鼠口服马兜铃酸I的半数致死量（LD50）及细辛药材中马兜铃酸I的限量,确定马兜铃中马兜铃酸的限量。结果马兜铃酸Ⅲ、7-羟基马兜铃酸Ⅰ、马兜铃内酰胺Ⅰ、马兜铃酸Ⅰ分别在0.34-31.90、0.32-30.20、0.12-28.10和0.21-41.30μg/mL范围内线性关系良好。马兜铃中马兜铃酸Ⅰ或马兜铃总酸的限量为0.000 3%。结论该方法准确可靠,可用于马兜铃中马兜铃酸的限量测定。

液质联用法测定鹭鸶咯丸中马兜铃酸类成分

目的:为明确鹭鸶咯丸是否含有马兜铃酸Ⅰ等马兜铃酸类成分,建立其马兜铃酸类成分的液质联用检测分析方法。方法:采用岛津Shim-pack Velox C_(18)色谱柱(100 mm×2.1 mm,2.7μm),以甲醇-0.1%甲酸溶液(含5 mmol·L^(-1)甲酸铵)为流动相梯度洗脱;电喷雾正离子模式(ESI^(+)),多反应监测(MRM)模式,对鹭鸶咯丸中7个马兜铃酸类成分进行初步筛查,并建立3个马兜铃酸成分的液质联用检测方法。结果:15批鹭鸶咯丸样品中检出马兜铃酸Ⅰ(0.003~0.011μg·g^(-1))、马兜铃酸Ⅳa(0.169~0.260μg·g^(-1))和马兜铃内酰胺Ⅰ(0.036~0.169μg·g^(-1)),进样量在相应范围内线性关系良好(r≥0.999 9),平均加样回收率分别为96.1%(RSD为1.63%)、99.4%(RSD为1.27%)、96.4%(RSD为2.98%),精密度及方法重复性均良好。结论:所建立的方法准确、灵敏、可靠,可用于鹭鸶咯丸中7个马兜铃酸类成分的筛查,且可用于上述3个马兜铃酸成分的分析,可为鹭鸶咯丸的质量控制及其安全使用提供参考。

UPLC-MS/MS测定追风透骨丸中马兜铃酸类成分含量

目的:建立超高效液相色谱-质谱法(UPLC-MS/MS)同时测定追风透骨丸中马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲ和马兜铃内酰胺Ⅰ的含量。方法:采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm);以乙腈-0.1%甲酸水溶液(含5 mmol·L^(-1)甲酸铵)为流动相梯度洗脱,流速为0.3 mL·min^(-1),用电喷雾离子源,在多反应监测模式下采用外标法测定。结果:4个成分在2~250 ng·mL^(-1)线性关系良好,r均大于0.999,在20 ng·mL^(-1)添加水平的平均回收率分别为104.2%、75.7%、112.0%、105.4%,RSD为2.8%~6.1%,方法定量限为0.002~0.100μg·g^(-1)。7批样品中均未检出马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲ,马兜铃酸Ⅰ检出量为0.09~0.41μg·g^(-1),马兜铃内酰胺Ⅰ检出量为0.62~1.30μg·g^(-1)。结论:该方法专属性好、灵敏度高、结果准确,可为追风透骨丸中马兜铃酸的质量控制提供参考。

基于多成分含量测定结合化学计量法评价水族药材骂广瓦质量

目的:建立高效液相色谱法测定水族药材骂广瓦中甲基丁香酚、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃内酰胺Ⅰ、马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酮的含量。方法:采用Welch C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),以乙腈-7.0 mmol/L磷酸缓冲溶液(pH=2.3)为流动相,梯度洗脱,流速:1.0 mL/min;检测波长:230 nm;柱温:40 ℃。采用SPSS 21.0及SIMCA 13.0软件进行综合分析评价骂广瓦药材的质量。结果:各组分在一定范围内呈线性关系,回收率在97.77%~100.16%之间,RSD在0.91%~2.19%之间;定量数据经统计学软件分析,甲基丁香酚、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃内酰胺Ⅰ可作为影响差异的主要成分,OPLS-DA图也可直观的区别不同产地的样品。结论:该方法简便、准确可靠,可为骂广瓦的质量控制提供依据。

UPLC-MS/MS法测定再造丸中的4种马兜铃酸类成分

目的采用超高效液相色谱-串联质谱法测定再造丸中马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲ、马兜铃内酰胺Ⅰ的含量。方法采用WatersAcquityBEHUPLCC_(18)色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm),以甲醇-0.1%甲酸溶液(含5mmol·L^(-1)甲酸铵)为流动相,梯度洗脱,流速0.3mL·min^(-1),采用电喷雾离子源,正离子模式下,多反应监测模式下,用外标法定量。结果4种马兜铃酸类成分在各自浓度范围内的线性关系良好(r>0.9990),平均加样回收率为88.4%~102.5%,RSD均小于5%。结论所用方法的专属性好、灵敏度高、结果准确,可为再造丸的质量控制提供参考。