马尾松毛虫质多角体病毒NS5蛋白的表达和功能初步分析

马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株第9个片段编码非结构蛋白NS5,利用pET-32a(+)载体带有组氨酸标记的重组蛋白进行表达,获得纯化的重组蛋白。利用凝胶电泳阻滞检测试验(EMSA)检测蛋白和核酸的结合作用,结果表明NS5蛋白能与病毒基因组dsRNA结合。

马尾松毛虫质型多角体病毒S4的cDNA克隆及序列分析

从马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株中提取病毒核酸,回收、纯化第四片段S4,经RT-PCR扩增得到了S4的cDNA克隆并测定了其全序列。结果表明,S4全长由3262个碱基组成,包含一个编码1058个氨基酸的完整开放阅读框架。Blast同源分析显示,DpCPV s4与LdCPV S4、BmCPV S4和RRSV S2编码蛋白氨基酸的同源性分别为94％、92％和22％。另外,氨基酸序列部分区域与Methanosarcina mazei Goel的甲基化转移酶有同源性,且序列中含有鸟苷酸转移酶活性位点。

松毛虫赤眼蜂携带质型多角体病毒防治马尾松毛虫

在湖南两个林场试验的结果显示，用携带松毛虫质型多角体病毒的赤眼蜂防治松毛虫比未携带病毒寄生蜂的防治效果要高。两者的防治效果分别为９４．１％～９７．３％和７４．６％～８１．２％。赤眼蜂对寄主卵的发育程度有明显的选择性，寄主卵发育超过３０小时的很少受赤眼蜂寄生。用携带病毒赤眼蜂传播病毒可以增加松毛虫的死亡率。用赤眼蜂传播病毒的方法比在林间喷洒病毒可节省大量的病毒剂。

家蚕对马尾松毛虫质型多角体病毒的敏感性

用虫体克隆技术 ,对马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株 (DpCPV HN)进行了分离纯化 ,鉴定为质型多角体病毒 1型。以家蚕春蕾×镇珠杂种F1 代及自交的F2 代 4或 5日龄幼虫进行毒力测定 ,以纯化的家蚕质型多角体病毒对F1 代幼虫的毒力测定为对照。结果表明 :家蚕品种春蕾×镇珠对家蚕质型多角体病毒敏感 ,马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株能引起其感染发病 ;马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株感染家蚕品种春蕾×镇珠F1 代幼虫和F2 代幼虫 2 8天后的半致死剂量(LD50 )分别为 885个和 18个CPB (质多角体 ) ,前者为后者的 4 9倍。马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株感染后的家蚕 ,其结茧率、化蛹率、羽化率、全茧量、茧层量和单蛾产卵数均有所下降 ,全茧量、茧层量、茧层率和单蛾产卵数与病毒感染剂量之间无显著关联。

甜菜夜蛾增殖马尾松毛虫质型多角体病毒研究

以甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)作为替代宿主增殖马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)的研究结果表明,DpCPV在甜菜夜蛾体内连续传代3次后得到的DpCPV-Se3与DpCPV具有相同的电泳图谱;多角体和病毒粒子在电镜下观察,未发现形态上的明显变化.生测结果表明,DpCPV-Se3与DpCPV回接松毛虫试验,其半数致死浓度分别为0.92×103 PIB/mL和1.44×103PIB/mL,二者毒力差异不显著.以甜菜夜蛾增殖DpCPV,多角体产量达到2.34×108PIB/头.用DpCPV-Se3和DpCPV的S7和S10片段分别进行同源性序列分析,结果没有明显变化.认为利用甜菜夜蛾增殖DpCPV用于生物防治具有可行性.

马尾松毛虫质型多角体病毒多角体蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对马尾松毛虫质型多角体病毒的增殖、纯化 ,获得一株单一类型的质型多角体病毒。提纯的病毒粒子经SDS-酚抽提 ,琼脂糖凝胶电泳分离基因组dsRNDA ,回收纯化第十片段S10。S10经DMSO变性 ,逆转录合成cDNA第一链 ,PCR扩增后 ,克隆在pGEM T载体上。对重组子进行限制性内切酶分析及序列测定 ,结果表明 ,克隆片段全长 76 3bp ,起始密码AUG位于 3～ 5残基 ,终止密码UGA位于 74 7～ 74 9残基。推测DpCPV多角体蛋白基因编码 2 4 8个氨基酸的多肽 ,分子量 2 8kD。和家蚕质型多角体病毒 (BmCPV)多角体蛋白基因相比较 ,核苷酸和编码氨基酸序列同源性分别为 89.3%和 97.6 %。

马尾松毛虫质型多角体病毒NS5蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对马尾松毛虫质型多角体病毒的增殖、纯化.获得一株单一类型的质型多角体病毒。提纯的病毒粒子经SDS-热酚法抽提,在使用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离基因组dsRNA,回收纯化第九片段S9。SgRNA双链经高温变性.使用正反两种引物逆转录合成cDNA双链,使用同样的引物经PCR扩增后,克隆在pMDl8-T载体上。利用两种引物组合,获得了大小两个亚克隆片段。序列测定结果表明,较小亚克隆片段长405bp,较大亚克隆片段长677bp,经过序列拼接,得到一个977bp的序列,其中包含一个963bp大的开放阅读框(ORF)。推测DpCPVS9基因编码一个320个氨基酸的多肽,分子质量35.66kDa。和家蚕1型质型多角体病毒的I株(BmCPV-I1 strain)位于第几片段的。NS5蛋白基因相比较,核苷酸和编码氨基酸序列同源性分别为86.0％和93.4％。

日本赤松毛虫质型多角体病毒Dendrolimus Spectabilis CPV对马尾松毛虫的生物测定

应用日本赤松毛虫质型多角体病毒(以下简称JDS-CPV)对马尾松毛虫第一代3龄和5龄幼虫进行了生物测定。结果表明,JDS-CPV对3龄和5龄幼虫的LC_(50)分别为1.6×10~5CPB/ml和3.3×10~5CPB/ml。其回归直线方程分别为Y=2.44+0.49x和Y=1.83+0.57x。对一代3龄虫的LD_(50)为2.1×10~3CPB/ml,回归直线方程为Y=1.72+0.98x。以1×10~8CPB/ml浓度为例的LT_(50),3龄虫为8.5天,5龄虫为13天。证实JDS-CPV对我国马尾松毛虫有较好的毒力。

马尾松毛虫质型多角体病毒在昆虫细胞系中的离体增殖研究

本文报道了马尾松毛虫质型多角体病毒（简称ＤｐＣＰＶ）在５株昆虫细胞系，即棉铃虫卵巢细胞系ＳＦＥ－ＨＡ－８３１与ＳＦＥ－ＨＡ－８２１２、家蚕细胞系Ｂｍ－Ｎ、粉纹夜蛾细胞系ＴＮ－３６８和草地贪夜蛾细胞系Ｓｆ－２１中的增殖。证明ＤｐＣＰＶ可在ＳＦＥ－ＨＡ－８３１、ＳＦＥ－ＨＡ－８２１２、ＴＮ－３６８和Ｓｆ－２１４株细胞系中增殖。其中ＳＦＦ－ＨＡ－８３１细胞能同时复制几种型混合的ＤｐＣＰＶ；细胞的感染率在２０％－３５％左右，每个感染细胞约可产生５０－１００个多角体；感染细胞己传代２０次以上；离体和活体增殖的病毒的形态、感染力和核酸带谱等特征均保持稳定。

影响棉铃虫增殖马尾松毛虫质型多角体病毒的条件因子的初步探讨

棉铃虫为马尾松毛虫多角体病毒 (DPCPV)理想的替代寄主。试验结果表明 ,不同接毒方法、接种浓度、接种温度及接种虫龄对棉铃虫增殖病毒有影响 ,以病毒涂在人工饲料表面的接毒方法、2 0～ 2 3℃温度及 3龄虫为最佳组合条件。由于利用棉铃虫生产出的病毒 (Ha DPCPV)容易诱发棉铃虫本身的多角体病毒 (NPV) ,尤其对那些带有NPV源的虫种 ,Ha DPCPV不宜作毒种 ,因此为慎重起见 ,最好用马尾松毛虫复制出的病毒作为生产毒种。

马尾松毛虫质型多角体病毒替代宿主的研究

马尾松毛虫(D? p? Walker)质型多角体病毒(DpCPV)能交叉感染粉纹夜蛾(Trichoph?)、斜纹夜蛾(Spadop?)、亚洲玉米螟(O?)、大蜡螟(Go?riamallonella)、菜青虫(P?)等鳞翅目幼虫,致病程度随昆虫种的不同而有较大差异,米蛾(Corc?)幼虫则对DpCPV不敏感.DpCPV对粉纹夜蛾幼虫的致死率可达100％.从粉纹夜蛾幼虫中复制出来的病毒(Tn-DpCPV)对松毛虫3～4龄和4～5龄幼虫的LC_?分别为1.73×10~5和3.06×10~?.在粉纹夜蛾幼虫中肠细胞中,多角体的形成是以小块状结晶开始,边包埋病毒粒子边相互聚合而成.

马尾松毛虫质型多角体病毒NSP1蛋白在昆虫细胞表达及定位

马尾松毛虫质型多角体病毒(Dendrolimus punctatus cytoplasmic polyhedrosis virus,Dp CPV)基因组S5片段编码一个由881个氨基酸组成、分子量为101 k D的非结构蛋白(NSP1)。为探寻Dp CPV NSP1蛋白的功能,将Dp CPV 1基因组S5-1片段的抗原区(1-600 bp)进行了原核表达,并将纯化蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。将稀释后的病毒液感染甜菜夜蛾幼虫,感染后每天解剖甜菜夜蛾并取中肠样品,通过Western blot检测NSP1蛋白的合成时间曲线。Western blot检测结果显示,S5片段表达的蛋白在病毒感染第1天就有合成,并且除了检测到全长的蛋白(101 k D)外,也检测到了80 k D和20 k D的蛋白条带,说明NSP1蛋白为早期表达蛋白,并且蛋白发生了切割。另外,首次对Dp CPV 1 S5片段进行了在昆虫细胞中表达和昆虫亚细胞定位,结果显示,昆虫细胞定位于细胞的细胞质。

松毛虫质型多角体病毒悬浮剂防治马尾松毛虫田间药效实验

本实验主要研究20亿PIB/mL松毛虫质型多角体病毒悬浮剂防治马尾松毛虫田间药效。实验结果表明:松毛虫质型多角体病毒的致死速度与其剂量有关,在500倍液剂量处理区,在1周内的死亡率达到67.6%,各试剂量区均有明显的持效性。第15天的防效效果为83.5%~90.4%;第30天的防效为85.6%~95%;松毛虫质型多角体病毒1000倍液剂量与500倍液剂量区与Bt区防治效果差异显著。

马尾松毛虫质型多角体病毒对棉铃虫生长发育的影响

为了弄清马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)对棉铃虫生长发育的影响,利用带毒饲料饲喂棉铃虫幼虫的方法进行了试验观察,结果表明:马尾松毛虫质型多角体病毒对棉铃虫幼虫具有一定的侵染性;棉铃虫幼虫的死亡率随病毒浓度的升高而增大;蛹重和羽化率随病毒浓度的升高而减小;幼虫历期受到的影响不显著。利用马尾松毛虫质型多角体病毒防治棉铃虫具有较好的开发运用前景。

马尾松毛虫质型多角体病毒单克隆抗体的制备和应用

纯化的马尾松毛虫质型多角体病毒（ＤｐＣＰＶ）云南文山株的病毒粒子经ＳＤＳＰＡＧＥ分析，其结构蛋白有１２０ｋｄ、１１６ｋｄ、１１０ｋｄ、６６ｋｄ和３３ｋｄ５个组分，而它的多角体蛋白含３０ｋｄ和２８ｋｄ两个主要组分。以纯化的ＤｐＣＰＶ粒子为抗原制备了２Ｄ５、２Ｄ１０、３Ｄ４和６Ｂ３共４种单克隆抗体，并测定了它们的亚类。制得的单克隆抗体用于ＤｐＣＰＶ的ＥＬＩＳＡ检测。对ＤｐＣＰＶ在棉铃虫卵巢细胞系ＳＦＥＨＡ８２１２和ＳＦＥＨＡ８３１中增殖动态的检测结果表明，ＤｐＣＰＶ感染培养细胞具有释放病毒量小和呈现持续感染等特点。用Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法在ＳＦＥＨＡ８３１细胞感染ＤｐＣＰＶ后第１８ｈ检测到病毒抗原的合成。运用所建立的免疫学检测方法，对几批采自ＤｐＣＰＶ防治林区的幼虫样品进行分析，结果表明，该方法适用于对ＤｐＣＰＶ的防治效果及其自然流行进行长时期、大规模的监测。

利用替代寄主生产马尾松毛虫质型多角体病毒的研究

ＤｐＣＰＶ对８种鳞翅目昆虫感染试验结果表明，棉铃虫最敏感，感染率达９７．０％。ＤｐＣＰＶ对棉铃虫的毒力ＬＣ５０＝７．６５×１０４ＣＰＢ／ｍｌ，浓度与感染死亡率相关性及回归方程均达到显著性。ＨａＤｐＣＰＶ与原毒种ＤｐＣＰＶ的形态特征相同；棉铃虫可用人工半合成饲料配方２在小塑料盒内单虫饲养，幼虫成活率达９８％以上、羽化率达９０％，平均蛹重０．４００６ｇ，平均产卵量７９７．７粒，卵孵化率达９８．２％；ＨａＤｐＣＰＶ对第一代４～５龄马尾松毛虫的毒力较强，ＬＣ５０＝１．１４×１０４ＣＰＢ／ｍｌ，与原毒种相比，毒力没有下降。用棉铃虫来生产ＤｐＣＰＶ，采用２３～２６℃、３龄虫、使用浓度１０５ＣＰＢ／ｍｌ以上，是比较理想的组合。将病毒喷在人工饲料表面喂虫，可获得较高的病毒产量，平均每条虫可产８．１３亿ＣＰＢ，与用原宿主生产的产量相接近。用ＨａＤｐＣＰＶ防治第一、二代４～５龄马尾松毛虫，防治效果达６０．２％～８４．０％。

马尾松毛虫质型多角体病毒非结构蛋白p44在Bac-to-Bac系统中的表达和亚细胞定位

为探寻马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV 1)p44蛋白的功能,构建了DpCPV 1基因组S8片段的原核表达体系,表达纯化蛋白后免疫家兔制备了多克隆抗体。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建了3种重组的杆状病毒质粒(Bacmid-p44、Bacmid-p44-e GFP和Bacmid-e GFP)。转染昆虫细胞Sf9进行表达,通过Western blot检测和蛋白的亚细胞定位观察。Western blot检测结果显示,Bacmid-S8在昆虫细胞Sf9中表达实际蛋白的大小为35 kD,比在原核系统中表达的蛋白(44 k D)略小;利用激光共聚焦显微镜观察p44-e GFP的融合蛋白的亚细胞定位发现,融合p44的绿色荧光蛋白(eGFP)主要聚集在细胞质中,而未融合的eGFP则分布于整个细胞,说明DpCPV 1的p44蛋白定位于细胞质中。

利用棉铃虫为宿主增殖松毛虫质型多角体病毒

应用细胞质多角体病毒JDS-CPV在日本防治赤松毛虫(Dendrolimus spectabilis)以及在我国台湾省防治马尾松毛虫(D.punctatus)均取得较好的效果。自1983年以来,利用JDS-CPV在我国广东、云南、浙江、安徽等省防治松毛虫,也都具有很好的效果。JDS-CPV的复制,过去主要是利用林间的松毛虫。如何使之成为周期性的连续生产。

松毛虫质型多角体病毒的宿主域与交叉感染

自 1956年从赤松毛虫Dendrolimusspectabilis上首次发现赤松毛虫质型多角体病毒 1型 (D .spectabiliscytovirus 1,DsCPV 1)以来 ,先后从马尾松毛虫D .punctatus、油松毛虫D .tabulaeformis、赤松毛虫、德昌松毛虫D .p .tehchangensis、文山松毛虫D .p .wenshangensis和落叶松毛虫D .superans上发现了质型多角体病毒 (cytoplasmicpolyhedrosisvirus ,CPV)。病毒基因组dsRNA电泳图谱分析表明 ,这些松毛虫CPV的不同分离株均属于质型多角体病毒 1型 (cytovirus 1)。这些松毛虫CPV病毒可以感染鳞翅目 10科 3 5种昆虫 ,其中对多种昆虫具有很高的感染力和良好的杀虫效果 ,可以从中筛选替代宿主生产松毛虫CPV杀虫剂 ,用于害虫生物防治。松毛虫CPV接种某些昆虫后病毒的基因组dsRNA电泳图谱发生了改变 。