我国4个不同地区周期型马来丝虫成虫氨基酸的比较分析

已有文献报道我国不同地区的周期型马来丝虫的生物特性存在一些微小差异［１－３］。为进一步探讨我国不同地区的马来丝虫是否存在种内分化，作者采用反向高效液相色谱对我国同一纬度的４个不同地区周期型马来丝虫成虫（贵州独山株、四川乐山株、淅江安吉株、福建建阳株）...

周期型马来丝虫副肌球蛋白基因真核表达重组质粒构建

提取周期型马来丝虫总RNA。跟据已知的马来丝虫副肌球蛋白(BmPmy)基因序列,设计合成引物,并引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点,应用RT-PCR技术,扩增BmPmy基因片段,克隆至载体pGEM-T中,经PCR和双酶切鉴定后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-BmPmy,并转染COS-7细胞后进行RT-PCR分析。转染的COS-7细胞高水平表达周期型马来丝虫副肌球蛋白mRNA,结果与预期相符。

马来丝虫长爪沙鼠动物模型保种衰退期的观察

目的 观察马来丝虫经长爪沙鼠传代的衰退情况。 方法 用马来丝虫微丝蚴感染中华按蚊 ,收集感染期幼虫 (L3) ,通过腹腔接种感染长爪沙鼠 ,连续观察 3 3代长爪沙鼠体内马来丝虫微丝蚴的发育情况。 结果 从 1974年建立的马来丝虫长爪沙鼠动物模型至今 ,通过 3 3代传代 ,发现随着转种代数增加 ,从第 2 8代起长瓜沙鼠的阳性率逐年下降 ,由 2 8代的 80 %下降至 3 2代的 16% ,到 3 3代时阳性率降为 0。 结论 经过较长期的传代 ,马来丝虫幼虫难以在长爪沙鼠体内发育繁殖。

马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、序列分析及编码产物B细胞表位预测

根据GenBank中马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(BmG3PD基因)序列设计引物,以马来丝虫mRNA为模板,RT-PCR扩增BmG3PD基因,将其克隆入pGEM-T载体,转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,筛选阳性克隆。经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及PCR鉴定,获得阳性重组质粒pGEM-BmG3PD,经序列分析及同源性比较,以及对其编码产物进行B细胞表位预测,结果表明PCR扩增的特异性条带为1020bp,与预期相符,与GenBank已知基因序列同源性为99%。编码产物B细胞表位预测,氨基酸区域可能在22～36、242～255、303～318和326～336位。

影响马来丝虫对长爪沙鼠感染率因素的观察

目的：探讨影响马来丝虫对长爪沙鼠感染率的因素。方法：用含马来丝虫感染期幼虫（Ｌ３）生理盐水感染长爪沙鼠，并分别加用抗生素、葡萄糖或培养液ＲＰＭＩ１６４０，观察接种鼠的存活率、感染率和感染度。结果：用含Ｌ３生理盐水组鼠存活率为８０．９％，存活鼠感染率为６０．５％，高感染度率为４３．４％。加用抗生素组，鼠存活率为９８．８％，存活鼠感染率为５２．９％，高感染度率为３０．６％。加用葡萄糖或ＲＰＭＩ１６４０组，鼠存活率（分别为９８．０％和９１．２％）、感染率（分别为６８．８％和６７．７％）和高感染度率（分别为５０．０％和５１．６％）均较高。长爪沙鼠感染马来丝虫浙江株（６代），存活鼠感染率和高感染度率均较贵州株（３１代）高。结论：加用抗生素能提高感染鼠存活率，但其感染率和感染度降低。加用葡萄糖和ＲＰＭＩ１６４０，能提高感染鼠存活率、感染率和感染度。长爪沙鼠对浙江株（６代）较贵州株（３１代）易感。

非放射性马来丝虫DNA探针pBm15-F-Dig的制备及其用于微丝蚴检测的研究

本文报道以异羟基洋地黄毒苷配基(Dig)标记种特异的马来丝虫重组DNA片段,制备非放射性DNA探针,并用于微丝蚴检测的初步结果。含有马来丝虫特异DNA片段的重组质粒pBm15转化入感受态大肠杆菌JM101,筛选扩增后提取质粒DNA,经限制性内切酶EcoRI/SalI消化,低融点琼脂糖凝胶电泳分离特异片段,随机引物法以Dig标记。检测结果表明,该探针可检出lpg同源DNA,240pg的微丝蚴DNA,100μl病人血样中的3.5～7条微丝蚴,与10ng的人白细胞DNA和正常人血样不发生杂交反应。

周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶基因原核和真核表达质粒的构建

目的构建我国流行的周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶(BmCP)基因原核和真核表达质粒,为进一步研究奠定基础。方法从周期型马来丝虫虫体中提取总RNA,反转录成cDNA,设计合成引物,以cDNA为模板,通过PCR从cDNA中扩增出目的基因,扩增产物经初步鉴定后将其克隆人pMD18-T载体.进行双酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性重组质粒,进行测序分析和同源性比较。阳性克隆的质粒亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+).转化感受态大肠埃希菌(E.coli)DH5α,筛选阳性克隆,用PCR和双酶切鉴定阳性重组子。结果RT-PCR扩增出1条约1201 bp的特异性条带,重组质粒双酶切和以质粒为模板的PCR结果与预期相符,DNA序列分析与GenBank已知的基因序列同源性为99%。构建了真核重组表达质粒peDNA3.1-BmCP。结论成功构建了周期型BmCP原核和真核重组表达质粒,为进一步研究该基因的功能提供了条件。

马来丝虫肌球蛋白部分编码基因Bm-M55的克隆与真核表达

根据马来丝虫肌球蛋白部分编码基因(Bm-M55)序列设计引物,以其微丝蚴总RNA为模板,反转录PCR扩增目的基因。用TA克隆方法将目的基因克隆至载体pGEM-TEasy中,经PCR和双酶切鉴定并测序后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/Bm-M55,转染COS-7细胞后进行RT-PCR验证。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)对获得重组蛋白Bm-M55进行分析和鉴定。RT-PCR鉴定结果显示,转染的COS-7细胞表达了Bm-M55基因,根据克隆的目的基因序列推导的氨基酸序列与GenBank(登录号为AAA27858)中的一致,重组蛋白Bm-M55相对分子质量(Mr)约为55000。

感染马来丝虫微丝蚴中华按蚊元素的分析

应用原子吸收光谱分析仪对中华按蚊的羽化蚊、吸正常人血后0d、5d、8d、12d、18d及感染马来丝虫微丝蚴后5d、8d、12d、18d的中华按蚊虫体内13种元素含量的变化进行了分析。这13种元素由钾、钠、钙、镁等4种常量元素和铁、锌、镍、铝、钢、铅、铜、锰、铬等9种微量元素组成。结果表明，非感染马来丝虫微丝蚴中华按蚊体内元素的含量随蚊虫的发育而增减不一，减少明显的有锌、铁、镁、铜等，而钙、钾等却有所增加。感染蚊与非感染蚊相比较，多种元素的含量明显减少，于感染第5d，有铁、锌、钾、钙、钠、铝、钢、铅、铜、锰等10种；第8d有除钙、镁以外的11种；第12d有除钙、镁、铜、镍外的9种；第18d有钾、镍、铝、镉、铅、锰、铬等7种元素的含量显示出非常明显的差异。

宿主对周期型马来丝虫微丝蚴细胞毒作用的体内研究

目的以我国流行的周期型马来丝虫为研究对象，研究宿主体内清除虫体、减轻虫体负荷、控制丝虫感染的免疫效应机制。方法提取纯净的周期型马来丝虫微丝蚴（ｍｆ）装入微孔实验盒，然后植入 ＳＤ大鼠体内，在不同时间观察机体免疫系统对ｍｆ的杀伤作用。结果含ｍｆ的３．０μｍ微孔盒内，迁入的细胞量随植入时间延长而逐渐增多。迁入的细胞种类及百分率，各实验组之间无明显差异。免疫血清组ｍｆ被效应细胞粘附、杀伤率均明显高于正常血清组。免疫血清用抗ＩｇＧ免疫球蛋白处理后，粘附细胞虫体及虫体死亡率都大大下降。 ３．０μｍ微孔盒内大量效应细胞粘附于虫体表面。扫描电镜下，观察到效应细胞粘附的虫体表面出现坏死、剥脱。结论ｍｆ对宿主效应细胞有一定的趋化作用。宿主体内存在着抗体介导的细胞毒作用，参与细胞毒作用的抗体主要是ＩｇＧ。其主要的效应细胞是中性粒细胞、巨噬细胞和嗜酸粒细胞。

周期型马来丝虫HSP70基因原核表达载体的构建及表达产物的分析

目的 在大肠埃希菌宿主系统中表达周期型马来丝虫热休克蛋白70（HSP70）基因，并对表达产物进行SDS—PAGE分析。方法以重组质粒pGEM—T—HSP70为模板，根据报道的HSP70基因序列设计合成一对引物，用PCR法扩增HSP70基因（包括完整开放读码框架片段及其上下游序列共长2198bp），PCR产物定向插入原核表达载体pGEX-4T-3中，构建的重组质粒pGEX-4T-3-HSP70经双酶切鉴定。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21（DE3），用IPTG诱导GST．Tag融合蛋白的表达。经SDS—PAGE分析并经凝胶图像分析确定目的蛋白的表达水平。结果重组表达质粒pGEx-4lT-3-HSP70全长约7200bp，经双酶切后应得到长度为4968bp的载体和2198bp的目的基因2个片段，1％琼脂糖凝胶电泳显示结果同预期完全相符。HSP70相对分子质量（Mr）为70×10^3，质粒pGEX-4T-3的融合部分（GST．Tag）表达产物的胁约为26×103，将重组质粒转化BL-21（DE3）菌。经IPTG诱导表达，菌体蛋白的SDS—PAGE图谱显示，诱导组出现特异性蛋白表达条带，其Mr约100×10^3，与预计大小相同。目的蛋白占菌体总蛋白的12％左右。结论 成功地构建了重组原核表达载体pGEX一4T一3-HSP70：周期型马来丝虫HSP70基因可在大肠埃希菌中稳定表达，为制备和纯化表达蛋白以及丝虫病疫苗的进一步研究打下基础。

周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶基因的扩增、克隆及序列分析

[目的]克隆周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease of periodic Brugiamalayi,BmCP)基因到原核载体中,测定其序列,为进一步的研究奠定基础。[方法]从周期型马来丝虫虫体中抽提总RNA,以mRNA为模板,采用RT-PCR法体外扩增出BmCP基因序列,扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pMD18-T载体,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α,筛选阳性克隆,进行双酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性重组质粒pMD18-T-BmCP,经测序验证,并进行同源性比较。[结果]RT-PCR扩增出一条约1201bp大小的特异性条带,重组质粒双酶切和以质粒为模板的PCR结果与预期相符,DNA序列分析与GeneBank已知的基因序列同源性为99%。[结论]成功构建了周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶重组质粒pMD18-T克隆载体,为进一步研究该基因的功能提供了条件。

周期型马来丝虫CPI基因真核表达载体的构建和免疫学研究

目的构建周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(BmCPI)基因真核表达载体pcDNA3.1-BmCPI,并观察其在小鼠体内的免疫应答反应。方法以周期型马来丝虫总RNA为模板,逆转录PCR(RT-PCR)扩增目的基因片段。与pGEM-T Easy克隆载体连接,筛选出阳性克隆,经PCR和双酶切鉴定后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1,构建pcDNA3.1-BmCPI表达载体。将48只小鼠随机分为4组,每组12只,分别为健康对照组、空质粒组、pcDNA3.1-BmCPI组和pcDNA3.1-BmCPI/CpG组,分别注射PBS 100μl、空质粒pcDNA3.1 100μg、重组质粒pcDNA3.1-BmCPI100μg和重组质粒pcDNA3.1-BmCPI 100μg+佐剂CpG 30μg,采用左后腿胫前肌注射免疫。每2周1次,共3次,于末次免疫后第4周,用RT-PCR方法检测小鼠注射部位肌肉组织内目的基因转录情况。于末次免疫后第4和第6周,用噻唑蓝(MTT)法检测小鼠T淋巴细胞刺激增殖水平。于末次免疫后第2、4和6周,用ELISA法检测小鼠血清γ干扰素(IFN-γ)和白介素-4(IL-4)水平。结果成功构建了pcDNA3.1-BmCPI真核表达载体,基因片段大小为621 bp。该真核表达载体免疫小鼠后,从小鼠肌肉组织扩增出目的基因。末次免疫后第4和第6周,2个免疫组小鼠淋巴细胞刺激增殖指数均显著高于健康对照组和空质粒组(53.789±1.937、59.735±4.139和61.975±1.029)(均P<0.05),2个免疫组间差异无统计学意义(P>0.05)。于末次免疫后第2、4和6周,pcDNA3.1-BmCPI组和pcDNA3.1-BmCPI/CpG组小鼠血清IFN-γ水平随时间延长逐渐升高,分别为69.544±3.145和106.069±7.518、120.019±5.968和136.229±7.198、149.109±2.700和178.429±1.126,均显著高于健康对照组和空质粒组(28.264±1.129、35.179±1.029和40.110±1.176)(均P<0.05),其中末次免疫后第2和第6周,pcDNA3.1-BmCPI/CpG组IFN-γ水平显著高于pcDNA3.1-BmCPI组(均P<0.05)。于末次免疫后第4和第6周,2个免疫组的IL-4水平均显著高于健康对照组和空质粒组(均P<0.05),2个免疫组间差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论 pcDNA3.1-BmCPI真核表达载体能在小鼠体内转录,并可诱导免疫应答。

贵州两个不同地区周期型马来丝虫成虫氨基酸的组成研究

应用高效液相色谱对贵州省内的两个不同地区周期型马来丝虫（贵州独山株、贵州荔波株）成虫的１８种氨基酸进行了检测和分析。结果显示贵州独山株与荔波株马来丝虫均检出１７种氨基酸，两株丝虫有１６种相同氨基酸。两株氨基酸的总含量无明显差异（Ｐ＞０．０５）。但独山株有丝氨酸，缺酪氨酸，而荔波株含酪氨酸，缺丝氨酸。

PCR及PCR-ELISA法检测蚊体内马来丝虫幼虫

目的：建立一种检测蚊体内马来丝虫幼虫的灵敏、快速、特异的方法。方法：选择应用ＰＣＲ及ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ法检测马来丝虫幼虫ＤＮＡ的最佳反应条件，并在该条件下分别以马来丝虫Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期幼虫各１条作模板，测定检测的灵敏度及检测实验室人工感染中华按蚊体内的马来丝虫幼虫。结果：ＰＣＲ及ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ法均能检测出１条Ⅰ期幼虫（Ｌ１），而ＰＣＲ的检测下限为１／１０条Ｌ１，ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ检测下限为１／１００条Ｌ１；将分离的感染期幼虫加阴性蚊媒进行粗提、扩增及电泳，结果未见明显的扩增条带，扩增产物作ＥＬＩＳＡ检测，全部为阴性；个体解剖人工感染的中华按蚊１２０只，分别收集１１３只阳性蚊体内的幼丝虫，用两种方法检测，结果均为阳性。结论：初步建立了ＰＣＲ及ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ法检测蚊体内马来丝虫幼虫的方法。

我国周期型马来丝虫六个省区虫株氨基酸的比较分析

目的 本实验进行丝虫种内分类学研究探讨我国六个省七个不同地区马来丝虫是否存在种内的生物学特性差异。方法 采用ＨＰＬＣ对贵州独山株、贵州荔波株、四川乐山株、湖北谷城株、安徽泾县株、浙江安吉株、福建建阳株马来丝虫成虫的１８种虫体氨基酸含量及种类进行分析比较。结果 七个地区马来丝虫虫体氨基酸的总含量经统计分析无明显的差异（Ｐ＞ ０．０５），碱性氨基酸、酸性氨基酸以及芳香族氨基酸亦无明显的差异（Ｐ＞ ０．０５），但在一些种类的氨基酸含量高低和个别氨基酸的缺如有一定的差异。结论 七个虫株丝虫虽有微小的生物学差异。

聚合酶链反应检测蚊体内马来丝虫幼虫的实验

目的 建立一种特异、灵敏和简捷的聚合酶链反应 (PCR)检测蚊体内马来丝虫幼虫的方法。方法 在应用一种新的模板纯化处理技术 (Microcon 10 0 )基础上 ,采用适应于检测我国马来丝虫的两套DNA扩增引物(P1、P2与P3、P4) ,对实验感染马来丝虫的中华按蚊进行扩增检测。结果 两套引物均可检出蚊体内不同发育期幼丝虫 (L1、L2 和L3) ,其灵敏度达 1只蚊体内 1/ 6 4条L1和 2 0 0只群体蚊中含有 1只感染蚊 (体内有 1条L3)的水平 ,而对犬恶丝虫及未感染蚊却不能扩增出特异条带。结论 初步建立特异、灵敏和简捷的PCR检测蚊体内马来丝虫幼虫的方法。

体外培养周期型马来丝虫感染期幼虫

关于体外培养周期型马来丝虫（periodic Brugia malayi）感染期幼虫（L3）,近年来国内外有一些报道,系应用含哺乳动物组织细胞系或原代细胞的培养系统培养彭亨丝虫和马来丝虫L3,可使其幼虫发育至Ⅳ期蚴（L-4）或早期成虫（Chen and Howells,1979; Wong et al.,1982;Mak et al.,1983;郑惠君等,1984）。但未见应用含人体组织细胞系的体外培养系统培养布鲁属丝虫L3的报道。

马来丝虫病流行区防治后期年传播潜势的纵向观察

在以嗜人按蚊为主要媒介的马来丝虫病流行区，进行了与丝虫病传播有关的人群和媒介观察，采用Ⅰ、Ⅱ期幼丝虫发育至Ⅲ期幼丝虫的时间内蚊媒存活概率为校正值参与丝虫病年传播潜势计算。结果为终止防治前流行区内平均每人每年受到嗜人按蚊５０次感染性叮咬，可接种７０条Ⅲ期幼丝虫，终止防治后９年分别降至４次和４条，年传播潜势呈逐年下降，与流行区丝虫病流行趋势分析结果一致。认为用校正值参与年传播潜势的计算方法适用于防治后期丝虫病传播流行趋势的分析。

我国不同地区周期型马来丝虫基因组DNA多态性研究

目的 分析我国不同地区马来丝虫基因组的多态性。 方法 用随机扩增多态 DNA(RAPD)技术对我国 6省区周期型马来丝虫基因组 DNA多态性进行了检测。 结果 经 2 0个引物扩增得到 5 1个多态片段 ,6株丝虫共有片段 2个 ,特有片段 9个。 结论 片段共享度及聚类分析所得的 6株丝虫的亲缘关系与同工酶、电镜及氨基酸研究的结果基本一致 ,即地理位置相距近则亲缘关系密切。