粘质沙雷氏菌马来酸顺反异构酶表达纯化及酶学性质

从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)中扩增得到马来酸顺反异构酶基因。将该基因连接到p ET24a载体上,并在Escherichia coli BL21(DE3)中实现了成功表达。酶学性质研究表明,重组酶的比酶活力为48.01 U/mg。其最适温度为37℃,最适p H为8.4。在最适反应条件下,Km值为4.20 mmol/L,Vmax为1.27 mmol/(L·min),kcat为4.38 s-1,催化效率kcat/Km为1.04 L/(mmol·s)。研究结果进一步显示,马来酸顺反异构酶具备良好的热稳定性(55℃半衰期为1.5 h)及高达99%以上的转化率,为马来酸顺反异构酶的进一步研究和工业应用制备高纯度的富马酸提供了理论基础和支持。

固定化马来酸顺反异构酶合成富马酸

为了制备稳定高效的固定化酶转化底物马来酸来生产富马酸,本文将粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)来源的马来酸顺反异构酶与R5肽段融合表达,融合酶比酶活可达42 U/mg。将细胞破碎上清液用40%硫酸铵沉淀,再用终体积分数为0.1%的戊二醛在室温下交联1 h形成交联酶聚集体,最后用1 mol/L正硅酸甲酯包埋,固定化酶的酶活回收率达到60%。在55℃下,固定化酶的半衰期可达4 h(游离酶仅为0.5 h),进行8次重复催化反应后,可保留78%的初始酶活。将固定化马来酸顺反异构酶装入填充床反应器,连续转化10个批次后富马酸的转化率可保持在95%以上。该研究为马来酸顺反异构酶生产富马酸的工业化应用提供了借鉴。

重组大肠杆菌全细胞转化马来酸高效合成富马酸

重组Escherichia coli细胞催化马来酸合成富马酸时,细胞中富马酸酶将产物富马酸转化成苹果酸,转化率达15.5%,降低了富马酸的转化率和纯度。将E.coli BL21(DE3)基因组中fum A-fum C基因敲除,并高效表达马来酸顺反异构酶,重组菌BL21(DE3)△fum A-fum C/p ET24a-mai A经发酵罐培养,可产生64 g/L菌体,马来酸顺反异构酶表达量达306 U/m L。按照60 g/L的发酵液:2 mol/L富马酸为1∶4的体积比配置反应液,37℃反应1 h,富马酸转化率高达98.4%,仅产生0.7%的苹果酸副产物。该结果为全细胞催化法合成富马酸的工业化奠定了基础。