马氏珍珠贝软体酶法制备降糖肽的工艺优化及肽段分析

目的:以二肽基肽酶-Ⅳ(dipeptidyl peptidase,DPP-Ⅳ)抑制率和葡萄糖消耗量为指标优化马氏珍珠贝软体的酶解工艺,并对酶法制备的降糖肽进行分析。方法:以人肝癌细胞(HepG-2)胰岛素抵抗模型的葡萄糖消耗量、体外二肽基肽酶-Ⅳ(dipeptidyl peptidase,DPP-Ⅳ)抑制率为评价指标,比较筛选了酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶对马氏珍珠贝软体的酶解效果,通过单因素及正交试验分析酶解温度、料液比、加酶量、酶解时间等因素对酶解物降糖活性的影响,确定最佳酶解工艺,以液相串联质谱(Nano LC-MS/MS)分析酶解物中肽类物质组成。结果:酸性蛋白酶酶解的产物葡萄糖消耗量和DPP-Ⅳ抑制率优于其他种类蛋白酶,马氏珍珠贝软体制备降糖肽的最佳酶解条件为:45℃、3 h、料液比1:3.5(w:w)、加酶量1000 U/g,在此条件下的葡萄糖消耗量为37.53%、DPP-Ⅳ抑制率为74.21%。最佳工艺制备的马氏珍珠贝软体酶解物中93.88%的肽段分子量低于2000 Da,22.63%的肽段为疏水性肽段,74.92%的肽段N端至少有含有一个疏水性氨基酸。结论:本研究酶法制备的马氏珍珠贝软体降糖肽可通过抑制DPP-Ⅳ的活性及减少胰岛素抵抗发挥降糖作用,对功能食品的研发具有一定的指导意义。

超滤对马氏珍珠贝肉蛋白酶解液特性的影响

分别采用凝胶过滤色谱法和高效液相色谱法研究了马氏珍珠贝肉蛋白酶解液超滤前后肽的相对分子质量分布以及氨基酸组成的变化，分析了超滤过程中膜通量及感官特性的变化，并对超滤膜的选择性及分离效果进行了评价．结果表明：随着超滤时间的延长，马氏珍珠贝肉蛋白酶解液膜通量不断减小；透过液的鲜味明显提高，腥味和苦味基本消失；透过液中含有相对分子质量大于截留相对分子质量（5000）的多肽，超滤膜实际有效截留相对分子质量约为7000～8000，相对分子质量小于4500的多肽在透过液中得到有效富集；超滤处理后，透过液肽态氨基酸中鲜味氨基酸占总氨基酸的比例高于原酶解液，而苦味氨基酸和疏水性氨基酸占总氨基酸的比例均低于原酶解液．

Pancreatin酶解马氏珍珠贝肉蛋白过程中产物性质研究

研究了Pancreatin酶解马氏珍珠贝内蛋白过程中氨基酸、可溶性氮、肽的释放规律以及产物的风味评价。游离氨基酸和可溶性氮含量在酶解过程中逐渐增加,但不同氨基酸以及同一氨基酸在不同水解时间段释放速率均不一致,控制酶解马氏珍珠贝内蛋白可提高其营养价值。水解24h后产物中分子质量大于10 000 u的肽段几乎完全被降解;水解6 h后,Pancreatin降解分子质量10 000 u以下肽的能力较弱。酶解产物鲜味随酶解时间延长不断增强,苦味在开始酶解6 h内不断增加,随后下降。

基于网络药理学与分子对接研究马氏珍珠贝降糖活性肽

基于网络药理学及分子对接方法筛选马氏珍珠贝软体来源的具有潜在降糖活性的肽类成分。采用纳升液相串联质谱鉴定马氏珍珠贝软体中的主要蛋白质类成分;通过Peptide Cutter在线工具模拟酶切获得马氏珍珠贝软体来源的肽类成分;进一步借助SYBYL-X 2.0软件进行分子对接筛选潜在活性肽段;通过Swiss Target数据库收集活性肽段潜在靶点,采用GeneCards数据库和OMIM-GENE-MAP数据库收集2型糖尿病相关的疾病靶点;借助Cytoscape软件和STRING平台构建“肽段-成分-靶点”网络和蛋白质相互作用网络,进行可视化分析,筛选酶解肽的核心成分和关键靶点;利用Omicshare云平台对共同靶点进行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析;体外二肽基肽酶-IV(dipeptidylpeptidase-IV,DPP-IV)抑制率实验验证马氏珍珠贝软体肽段的活性。结果表明,肌动蛋白、肌球蛋白和微管蛋白为马氏珍珠贝软体主要蛋白质类成分,从模拟酶切肽段中筛选获得潜在降糖活性肽段28条及其对应基因靶点377个;确定2型糖尿病疾病靶点1705个;可视化分析筛选出25个关键靶点;富集分析显示,马氏珍珠贝软体酶解肽主要参与细胞增殖与凋亡、蛋白质代谢、信号转导、炎症反应等过程。活性验证结果表明,19条肽段具有体外DPP-IV抑制活性,其中26号活性肽段体外DPP-IV抑制活性最佳(IC_(50)=395μmol/L)。网络药理学和分子对接方法可用于筛选马氏珍珠贝软体中活性肽类成分,据此筛选的活性肽类成分可通过调控炎症、物质代谢、细胞凋亡等途径发挥降糖作用。