马流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立一种快速、有效的检测马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)的方法,以EIV中国分离株A/马/新疆/07(H3N8)制备的多克隆抗体为捕获抗体,原核表达的核蛋白(NP)制备的单克隆抗体为检测抗体,在国内首次建立了检测EIV的双抗体夹心ELISA方法。用该检测方法分别检测EIV、马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型和马乙型脑炎病毒阳性样品。结果表明,该ELISA方法具有良好的特异性;与常规检测EIV的血凝试验相比,其敏感性是后者的2.5～10倍;同时与H7N7亚型EIV有交叉反应。攻毒试验结果表明该方法可有效检测鼻腔分泌物中的EIV。该方法的建立为EIV的检测及早期防控提供了有效工具。

广西H3N8亚型马流感病毒耐药性分析

【目的】了解广西H3N8亚型马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)对抗流感病毒药物的耐药性,为临床科学用药提供参考。【方法】采用RT-PCR对广西H3N8亚型EIV分离株A/Equine/Guangxi/1/09(简称GX09株)进行M基因和NA基因扩增,测序分析M2基因和NA基因特征及其与耐药性相关的氨基酸位点,并进行生物学耐药性试验。【结果】GX09株M2基因的相关耐药性位点(L26F、V27A、A30T、S31N、G34E)均未发生变异;在NA基因相关耐药性位点方面,也仅在S247A位点处出现氨基酸替换,其他位点均较保守,未出现氨基酸替换。生物学耐药性试验结果表明,GX09株对金刚烷胺敏感,对奥司他韦已产生耐药性。【结论】广西目前流行的EIV对金刚烷胺敏感,在流感易发季节仍可选用烷胺类药物对广西地区的马流感进行预防和治疗。

应用TaqMan荧光定量PCR检测H3N8亚型马流感病毒

为建立马流感病毒(EIV)的检测方法,本试验针对H3N8亚型EIV血凝素(HA)基因高度保守序列设计并合成了2对引物和1条TaqMan荧光探针,建立了TaqMan荧光定量PCR方法。经用TaqMan荧光定量PCR、RT-PCR和病毒分离方法分别检测新疆等省135份疑似EIV马鼻拭子样品,其结果表明:3种方法的马流感检出率分别为54.07%、37.78%、0.89%;TaqMan荧光定量PCR可检出马流感病毒基因组RNA的灵敏度可达10拷贝/反应,而且与其他马呼吸道病毒均无交叉反应,具有良好的特异性、敏感性和重复性。该方法为H3N8亚型马流感的早期诊断及分子流行病学调查等提供了一种新的快速、准确的定量检测技术。

马流感病毒多重RT-PCR检测方法的建立

根据马流感病毒的M基因和HA基因的保守序列,设计了两对引物,MF和MR为通用引物,可以检测出H3N8和H7N7亚型EIV,目的片段227bp,HF和HR为H3N8亚型特异性引物,目的片段595bp。利用这两对引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了快速检测鉴别H3N8亚型EIV的多重RT-PCR技术。特异性和敏感性试验结果表明,该技术可以用于EIV的快速诊断和亚型鉴定。

马流感病毒(A/equine/Qinghai/1/94)核蛋白基因的序列测定及同源性分析

根据已发表的马流感病毒核蛋白基因序列 ,设计并合成一对特异性引物 ,经反转录_聚合酶链反应 (RT_PCR)成功扩增出了我国马流感病毒 (A/Equine/Qinghai/ 1/ 94 )核蛋白基因 ,将该片段连接到PGEM_T_EASY载体并转化DH5α ,提取阳性菌落的质粒经EcRo1酶切和PCR鉴定其大小为 1.5kb左右 ,对其测序并进行分析发现 ,与A/Equine /Kentucky/2 / 86、A/Equine/Miami/ 1/ 6 3等关系较近 ,同源率为 93.3%～_97.4 % ,而与我国马流感吉林A/Equine/Jilin/ 1/ 89株关系较远 ,同源率仅为 84 .6 %。

我国H3N8马流感病毒血凝素基因分子进化树的分析

根据已发表的马流感病毒血凝素基因序列 ,设计并合成一对特异性引物 ,经反转录 聚合酶链反应 (RT PCR)成功扩增出了我国马流感病毒青海株 (A Equine Qinghai 1 94)、吉林株 (A Equine Jilin 1 89)及黑龙江株 (A Equine Heilongjiang 1 89)血凝素基因 ,将片段分别连接到PGEM T easy载体并转化DH5α,提取阳性菌落的质粒经EcRo1酶切和PCR鉴定其大小均为 1 7kb左右 ,对其测序并构建HA基因进化树。经过比较分析 ,青海株与A Equine Kentucky 2 86、A Equine Miami 1 63等关系较近 ,核苷酸同源率为 97 3%～ 84 7% ,而与我国马流感吉林株和黑龙江株关系较远 ,同源率仅为 5 5 2 %。经过比较 ,青海株与我国香港 1

云南地区马流感病毒检测及其HA基因序列分析

马流感能引起马属动物的高度接触性呼吸道传染病。该病毒已知仅存在H7N7（马流感病毒1型）、H3N8（马流感病毒2型）两个亚型，目前仅H3N8亚型毒株在全球范围内引起马流感流行和暴发。采用A型及H3亚型特异性RT-PCR技术，检测云南疑似马流感病例鼻腔棉拭子样品；HA基因PCR扩增产物经纯化后，克隆至pMD18-T载体进行测序，并与已知代表性毒株对应序列进行比对及系统发育分析。研究发现云南马流感病毒与已知代表毒株血凝素基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别介于91．2％-99．2％和89．5％-98．4％，属于美洲谱系（American lineage）佛罗里达亚谱系（Florida sub-lineage）毒株。

H3N8亚型马流感病毒HA1基因原核表达载体的构建及表达

采用RT-PCR方法从马流感病毒中国分离株A/马/新疆/07(H3N8)中扩增的HA1基因片段,将其克隆到表达载体pET-28a(+)中,测序正确后转化入Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌表达出约53ku,以沉淀性形式存在的重组蛋白,且在37℃,0.4mmol/L IPTG条件下诱导8h表达效果最好。表达产物经切胶纯化后得到纯度较高的目的蛋白。经Western-blot分析,表达的蛋白与抗马流感病毒阳性血清发生特异性反应,证实该蛋白具有良好的反应原性。

马流感病毒(A/Equine/Qinghai/1/94)神经氨酸酶基因的克隆与同源性分析

本试验根据已发表的马流感病毒神经氨酸酶 (NA)基因序列 ,设计并合成一对特异性引物 ,经反转录_聚合酶链反应 (RT_PCR)成功扩增出了我国马流感病毒青海株 (A/Equine/Qinghai/1/94 )NA基因 ,将片段连接到PGEM_T_easy载体并转化DH5α ,提取阳性菌落的质粒经EcRo1酶切和PCR鉴定其大小均为 1.4Kb左右 ,对其测序并构建NA基因进化树。经过比较分析发现 ,我国马流感病毒青海株与A/Equine/Alaska/1/91、A/Equine/Tennessee/5 /86和A/Equine/Algiers/72等关系较近 ,核苷酸同源率为 98.2 %～ 97.4 % ;与我国马流感吉林株 (A/Equine/Jilin/1/89)关系较远 ,核苷酸同源率仅为72 .0 % ;而与H7N7亚型马流感病毒A/Equine/Prague/1/5 6核苷酸同源率仅为 38.0 %。

一株H3N8亚型马流感病毒的鉴定及HA基因序列分析

2016年4月北京某马场出现马流感疑似疫情,为确诊病原,从发病马群中采集鼻拭子接种鸡胚分离病毒,并进行血凝试验和血凝抑制试验、基因测序和BLAST比对分析。结果表明,从鼻拭子中分离到1株马流感病毒,命名为A/equine/Beijing/2016。血凝试验、血凝抑制试验及测序结果表明,该分离株为H3N8亚型。对分离株的HA基因进行遗传进化分析,表明该分离株属于H3N8亚型美洲谱系的佛罗里达Ⅱ群。对该分离株及国内近年来的马流感病毒分离株的HA氨基酸序列进行分析,发现该分离株相比于OIE推荐的疫苗候选株出现了一个重要的抗原漂移。马流感病毒HA基因的不断变异,提示有必要加强对国内马流感病毒的流行病学监测。

马流感病毒H3亚型血凝抑制试验抗原的研究

为研制马流感病毒(EIV)H3亚型血凝抑制(HI)试验抗原,本研究以华北地区分离的H3N8亚型EIV(A/Equine/Huabei/1/2007(H3N8))为种毒,经条件优化确定了其生产工艺。检测结果表明:制备的EIV H3亚型HI试验抗原与英国兽医参考实验室(VLA)生产的抗原具有同样的敏感性,对EIV感染马后9 d^10 d的血清可检测出抗体阳性;对马流感H3亚型灭活疫苗免疫后31 d的马血清检测抗体为阳性;检测美国肯塔基大学马病研究室提供的强阳性、中阳性和弱阳性血清以及阴性血清的效价,结果与瓶签标定的效价一致。而且,制备的抗原仅与EIV H3亚型阳性血清发生特异性反应,与EIV H7亚型、猪流感病毒H1亚型、猪流感病毒H3亚型等12种其他亚型的A型流感病毒阳性血清均不发生反应。研究结果显示,制备的抗原具有很好的敏感性和特异性,填补了国内空白,可以用于目前EIV H3亚型HI抗体的检测,为马流感的诊断和监测提供了有效的技术手段。

马流感病毒A/马/青海1/94株亚型鉴定及其HA基因序列特征

本试验用AI标准阳性分型血清对我国马流感病毒A/马 /青海 / 1/ 94进行了血凝素 (H)和神经氨酸酶 (N)的鉴定 ,并与马流感病毒吉林株、黑龙江株、北京株及国际标准株A/equine/Miami/ 2 / 6 3进行了对比 ,结果显示 ,1994年在我国青海省暴发的马流感病毒的亚型为H3N8;以反转录_聚合酶链式反应 (RT_PCR)扩增该株的血凝素基因 ,并克隆到pGEM_Teasy载体上 ,采用双脱氧末端终止法测定该cDNA片段共 1738个核苷酸序列 ,并推导出其编码的 5 6 5个氨基酸的序列。利用Genbankblast和基因进化树分析软件分析各毒株之间的亲缘关系 ,发现A/马 /青海 / 1/ 94与

马流感病毒的分离及其亚型的初步鉴定

1994年春我国西宁市附近暴发了马流感。本试验从现地典型发病又未经治疗的马采集了鼻甲、鼻分泌物、脾、咽、血液,用9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔接种、传代,进行病毒分离。最后从脾和鼻甲粘膜分离到2株病毒,经血凝试验和电镜检查,证明是马流感病毒,经标准毒株和抗标准毒株亚型抗血清以及现地采集的耐过马血清交叉进行血凝抑制试验证明该病毒为A型流感病毒A2亚型,命名为A/马-2/西宁/94。

H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体的制备及鉴定

以灭活马流感病毒(EIV)A/Equine/Jilin/1/1989(H3N8)为免疫原,免疫Balb/c小鼠,经常规细胞融合后,用血凝抑制试验(HI)和间接ELISA方法筛选获得3株(3C2、5G10和5A10)能稳定分泌H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株。其中3C2和5G10为IgG2α,5A10为IgM亚类,腹水抗体效价检测显示,3C2和5G10为1∶64 000,5A10为1∶32 000。HI和Western blot结果表明,3株单克隆抗体均为EIV血凝素特异性单克隆抗体。特异性试验结果表明,所获得的mAb不与H7N7亚型马流感病毒、马动脉炎病毒(EAV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、马日本脑炎病毒(JEV)发生交叉反应。研究为建立单克隆抗体介导的检测马流感病毒抗原和抗体的血清学方法以及为实现马流感标准化诊断奠定基础。

马流感病毒血凝素基因甲病毒复制子重组表达质粒的构建及其免疫效力评价

为评价马流感病毒(EIV)HA基因核酸免疫效果,本研究以甲病毒复制子载体pSFV1CS分别构建了表达EIV H3N8亚型的美洲型和欧洲型HA基因的重组真核表达质粒。并将其转染293T细胞,经间接免疫荧光鉴定表明HA基因获得表达;以重组质粒免疫的BALB/c鼠能够检测到特异性抗体产生,而且HI抗体水平持续升高,同时小鼠体内IFN-γ、IL-4分泌水平也有所升高。攻毒后小鼠表现轻度临床症状,但病毒分离和RT-PCR均未检测到病毒。上述结果表明,该重组质粒pSFV1CS-EIV-HA具有良好的免疫原性并且可以诱导免疫动物产生较高免疫应答的能力。

马流感病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上马流感病毒H3N8 HA和NA的基因序列,设计并合成了扩增HA和NA基因RT-PCR引物及NA基因荧光定量RT-PCR引物探针,经条件优化,建立的HA和NA RT-PCR方法检测下限为10 TCID50;荧光PCR方法检测下限为0.1 TCID50。对H5、H7、H9、H3N1、H3N2、Pi等6种病毒核酸进行扩增,发现具有良好的特异性,显示建立的方法具有高效、快速、特异、灵敏的特点,可用于马流感病毒的检测和监控。

H3N8亚型马流感病毒内蒙古株NS基因的克隆及序列分析

马流感病毒（Equine influenza virus，EIV）是马流行性感冒的病原体。马流感病毒的基因组为单股负链RNA，含有大小不同的8个独立的RNA片段，其第8片段为非结构蛋白基因，基因长890bp，编码非结构蛋白NS1和NS2。两者的相对分子质量分别为25ku和14ku。编码NS1的读码框连续，而编码NS2的mRNA需要剪切。序列分析表明，NS1和NS2有70个氨基酸重叠，并且在氨基端有9个氨基酸是相同的。在感染早期NS1被大量合成，

H3N8亚型马流感病毒拯救体系的建立

利用反向遗传学操作技术,以马流感病毒(EIV)A/Equine/Fuyun/2008/(H3N8)为亲本株,采用RT-PCR技术对该毒株的8个基因片段分段进行扩增,通过与双向转录载体pHW2000连接,重组质粒转染293T和MDCK共培养细胞,成功拯救出全部基因均来自亲本株的EIVrH3N8,生物学试验结果表明,rH3N8在鸡胚半数感染量、组织培养半数感染量、稳定性试验等方面都与亲本株保持一致。以猪流感病毒(SIV)A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)内部基因的重组阳性质粒替换rH3N8的相应基因,成功拯救出重组病毒rgH3N8。两拯救毒株经鸡胚一次传代的血凝效价分别为1∶32、1∶64,最高可达1∶1024、1∶2048;接种MDCK细胞54h后的血凝效价最高均可达1∶512。rH3N8亚型EIV的成功拯救及基因的成功替换,为流感病毒突破种间屏障分子机制的研究和流感基因工程疫苗株的筛选奠定了基础。

H3N8亚型马流感病毒RT-LAMP检测方法的建立

为了建立检测H3N8亚型马流感病毒的RT-LAMP方法,根据H3N8亚型马流感病毒HA基因序列,设计了2对LAMP引物,经过优化反应条件,建立了RT-LAMP检测H3N8亚型马流感病毒方法。结果表明,RT-LAMP方法能够在63℃恒温条件下、75min内实现目的基因片段的大量特异性扩增,通过荧光显色就可直接用肉眼判断结果。对H7N7亚型马流感病毒、马动脉炎病毒、马鼻肺炎病毒的核酸无交叉反应,具有较好的特异性;方法的灵敏度比常规RT-PCR的高10倍;该方法操作简便快速、省时省力,而且灵敏度高、特异性强,对H3N8亚型马流感病毒的检测具有实际的应用价值。

马流感病毒(H3N8亚型,Huabei株)对马的致病性研究

为研究从华北地区分离的H3N8亚型马流感病毒（Huabei株）对马的致病性,分别用E2、E3、E4、E5及E10代病毒液人工感染健康马,比较了不同代次毒株对马的致病性差异.研究表明,E2、E3代病毒以10^7.2～ 10^7.4EID50剂量经喷雾途径可使12 ～ 18个月龄的马出现持续性发热、咳嗽和流浆液性鼻液等典型马流感症状;同样剂量的E4、E5和E10代病毒感染马匹后仅表现为流浆液性鼻液.本研究确定了马流感病毒Huabei株的感染剂量及代次,为马流感灭活疫苗效果评价奠定了实验感染模型基础.