非洲马瘟病毒可视化RT-LAMP现场检测方法的建立

为建立非洲马瘟病毒(AHSV)可视化RT-LAMP检测方法,本研究根据AHSV外衣壳蛋白(VP7)基因保守序列设计2对特异性引物,通过反应条件优化建立了AHSV可视化RT-LAMP检测方法。结果显示,本实验所建立RT-LAMP方法的最佳反应条件为62℃1 h;利用该方法检测进口灭活冻干疫苗中的9个血清型AHSV以及马流感病毒、马传贫病毒、马动脉炎病毒和蓝舌病病毒的RNA,结果显示所有血清型AHSV RNA检测均为阳性,其它病毒RNA检测为阴性,该方法特异性较强;该方法最低可检测到3.2×10-9 ng/μL的RNA,敏感性是普通RT-PCR方法的1000倍。利用建立的RT-LAMP方法和普通RT-PCR方法对35份马血和5份驴血样品同时进行检测,结果显示二者阳性和阴性符合率均为100%。本研究在国内外首次建立了AHSV 9种血清型的可视化RT-LAMP检测方法,其具有特异性强、敏感性高、快速和高通量检测的优点,为非洲马瘟(AHS)快速的可视化现场诊断提供可行方法。

非洲马瘟病毒VP7基因的克隆与表达

为获得非洲马瘟病毒VP7蛋白,以用于制备AHS血清学诊断试剂并为AHS新型疫苗的构建奠定基础,笔者采用原核表达系统表达VP7蛋白。在GeneBank中查找非洲马瘟病毒VP7基因序列,人工合成VP7基因,将VP7基因片段克隆插入pBAD/Thio-TOPO表达载体,将重组质粒转入大肠杆菌TOP10。经测序鉴定,筛选获得VP7基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,经L-Arabinose诱导表达VP7融合蛋白抗原。SDS-PAGE分析表明以终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖进行诱导,4h后表达可达到高峰,融合蛋白质量约54.72kDa。Westernblotting检测和间接ELISA表明诱导表达的融合蛋白能与非洲马瘟病毒VP7单克隆抗体发生特异性反应,说明蛋白有特异的免疫学活性。

非洲马瘟病毒、西尼罗病毒和马冠状病毒的基因芯片检测技术研究

为探索建立马病病毒基因芯片检测方法,采用人工拼接的方式拼接了非洲马瘟病毒(ASHV)核酸序列,通过分子克隆技术获得西尼罗病毒(WNV)和马冠状病毒(ECV)的特异基因片段。用芯片点样仪逐点分配到处理过的玻片上,制备成检测芯片。以拼接、克隆的核酸序列为模板通过多重不对称RT-PCR进行特异性扩增和荧光标记后滴加到芯片上进行杂交,对杂交结果进行扫描检测和计算机软件分析。结果显示,制备的基因芯片可同时检测和鉴别上述3种病毒,ECV质粒样品、WNV质粒样品检测灵敏度为102拷贝;AHSV质粒样品检测灵敏度为104拷贝。其他病毒材料未出现荧光信号,验证了本方法的特异性。证明基因芯片技术可快速、准确和灵敏地同时进行多种病毒的检测。

非洲马瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

非洲马瘟病毒(AHSV)为双股RNA病毒,能感染所有马科动物。为建立一种AHSV快速检测方法,根据GenBank及作者所测AHSV 9个血清型VP7-ORF全长核苷酸序列,设计一对位于AHSV基因组S7片段的特异引物,然后进行荧光定量检测。经试验,证实该对引物对9种血清型的AHSV RNA均有特异性扩增,能检出特异荧光信号,而对与AHSV同属的蓝舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血症病毒(EHDV)及正常马淋巴组织和阴性对照均无扩增,无有效荧光信号可检出。以国家外来动物疫病诊断实验室已构建好的AHSV 9型pMD18-T-VP7质粒为标准品可建立良好的标准曲线,实现对检测样本的实时定量。本研究建立了模板预变性结合"三步"法敏感特异的AHSV实时荧光定量RT-PCR快速检测方法,检测灵敏度可达102拷贝/μL。

非洲马瘟病毒分子生物学研究进展

非洲马瘟病毒属呼肠病毒科环状病毒属，有9个血清型，是一种有10个节段（L1-L3，M4-M6，S7～S10）的双链RNA病毒，编码10个蛋白（VP1～VP7和NS1，NS2，NS3／NS3A）。VP2蛋白在病毒的各蛋白中变异率最大，有15个抗原位点，是病毒的血清型特异性抗原，能与病毒的中和抗体发生反应；VP7蛋白在病毒的各蛋白中最保守，是病毒的血清群特异性抗原。NS1蛋白在感染细胞中形成病毒特异性微管结构；NS3蛋白在病毒各蛋白中变异率位居第二，系统进化分析将NS3分成3个进化群（α，β和γ）。该病毒的分子生物学诊断技术主要有RT-PCR和核酸探针技术。

非洲马瘟病毒VP7和NS2双重荧光RT-PCR检测技术的建立与应用

利用DNAMAN软件对非洲马瘟病毒不同基因型代表株的序列进行分析,选择其高度保守的VP7和NS2基因设计合成引物和探针。人工分别合成包含有扩增区域的VP7和NS2核苷酸片段进行双向(T7和SP6)体外转录制备双链RNA(dsRNA)。使用制备的dsRNA在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上,建立了适用于非洲马瘟病毒检测的双重通用荧光定量RT-PCR检测技术。应用建立的方法对非洲马瘟病毒核酸,马流感病毒核酸,马流产沙门氏菌核酸,马链球菌兽疫亚种核酸,东、西部马脑脊髓炎病毒核酸进行检测,结果显示该检测技术可以有效检测非洲马瘟病毒核酸,而对其它病原核酸检测结果为阴性,证实本技术的特异性强、可靠性好。对已知拷贝数的dsRNA检测结果表明,所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达1.0×102拷贝/反应,相比于基于凝胶电泳常规RT-PCR方法,其灵敏度高10倍;而且双基因的检测设计思路更能保证病毒核酸的有效检测,防止漏检。在对248份临床样品的检测中,进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好,可满足非洲马瘟病毒快速诊断的需要。

含非洲马瘟病毒部分核酸序列的病毒样颗粒的研制

VP7蛋白是非洲马瘟病毒(AHSV)群特异性蛋白,其编码基因S7基因常被用作AHSV RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测的靶标基因。本研究旨在构建耐RNase的内含AHSV部分核酸序列的病毒样颗粒。首先合成S7基因保守序列,然后克隆到含有噬菌体包膜蛋白基因的带组氨酸纯化标签的假病毒表达载体pNH-MS2his上,成功构建原核表达载体pNH-MS2his-VP7。将重组质粒pNH-MS2his-VP7转化BL21(DE3),并进行诱导表达及镍离子亲和层析纯化后,得到含AHSV部分RNA片段的病毒样颗粒。试验证实该病毒样颗粒均匀性和稳定性良好,可作为AHSV PCR检测的质控品和标准品使用。

狂犬病毒、伪狂犬病毒、马瘟病毒、牛病毒性腹泻/粘膜病病毒和传染性牛鼻气管炎病毒的保存期试验

进行了狂犬病毒 (巴黎株固定毒 )、伪狂犬病毒 (闽 A株 ,苏联株 )、马瘟病毒 (I,II,III,IV,V,VII型 )、牛病毒性腹泻 /粘膜病病毒 (Oregon C2 4 V株 ,NADL株 )和传染性牛鼻气管炎病毒(NU/6 7株 )的保存期试验。试验结果证明 ,在 - 70℃以下温度保存 ,狂犬病毒巴黎株固定毒保存 1 0年以上 ,伪狂犬病毒闽 A株保存 1 1年以上 ,伪狂犬病毒苏联株保存保存 1 7年 ,马瘟病毒 I、II、III、IV、V和 VII型病毒保存 1 2年以上 ,牛病毒性腹泻 /粘膜病病毒 NADL株和 Oregon C2 4 V株保存1 6年以上 ,传染性牛鼻气管炎病毒 NU/6 7株保存 1

非洲马瘟病毒RT-LAMP检测方法的建立

为了建立非洲马瘟病毒(AHSV)环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测方法,基于AHSV VP7基因保守序列,设计2对特异性扩增引物。通过对反应体系中各组分浓度,反应温度及时间的优化,建立了快速、灵敏的AHSV RT-LAMP检测方法,并对该方法特异性、灵敏度、重复性进行探索。结果表明,在63℃恒温下反应45min,便可进行高效率的特异性扩增。反应产物经琼脂糖凝胶电泳和染料可视化鉴定,能够快速有效检测AHSV。用建立的方法检测马属动物易感的4种疫病病原,结果均为阴性,证实具有较高的特异性。灵敏度是RT-PCR的1 000倍。建立了AHSV RT-LAMP检测方法,具有快速、特异、灵敏、操作简单、设备要求低的特点,适合用于现场AHSV快速检测。

基于单克隆抗体的非洲马瘟病毒间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

【目的】为有效应对非洲马瘟(African horse fever,AHS)传入我国的风险,研究建立一种基于单克隆抗体(Monoclonal antibody,Mab)的非洲马瘟病毒(African horse fever virus,AHSV)特异性的间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)抗体检测方法,利用该方法对我国马匹进行非洲马瘟抗体监测。为有效诊断非洲马瘟提供血清学检测手段。【方法】首先利用AHSV VP7抗原免疫小鼠制备针对VP7抗原的单克隆抗体;其次通过对包被抗体浓度、蛋白浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度等反应条件的优化建立AHSV iELISA抗体检测方法。利用1000份血清确定该方法的临界值,并评估该方法的敏感性和特异性。由3位试验操作者分别对AHSV敏控阳性血清进行加速试验测定效价,评估该方法的稳定性。通过利用建立的方法对已知的10份AHSV阳性血清和400份阴性血清进行检测并与国外商品化试剂盒检测结果进行比较;最后用该方法对我国2021年18个省份或地区的947份临床样本进行检测来评估我国马匹中AHSV感染风险。【结果】获得了5株针对AHSV VP7抗原的单克隆抗体。通过对5株单克隆抗体筛选确定3G9单克隆抗体捕获抗原性能最佳。利用3G9抗体作为包被抗体,通过对不同反应条件优化建立了AHSV iELISA抗体检测方法。确定该方法的临界值为0.25;经比对试验证实本研究建立的AHSV iELISA方法的敏感性与商品化试剂盒相当。3位操作者分别对敏控血清进行检测,组内变异系数范围分别为3.19%—7.02%、0%—3.11%、0.27%—5.76%,组间变异系数为1.17%—5.03%。37℃加速试验表明AHSV阳性血清7 d内效价稳定,因此证明该方法具有良好的稳定性。该方法与商品化试剂盒进行比较两者总体符合率为100%。通过对我国18个省或地区的947份马血清进行检测,结果表明AHSV抗体阳性率为0%。【结论】成功筛选到了针对AHSV VP7的单克隆抗体,建立了一种基于单克隆抗体的AHSV iELISA抗体检测方法,该方法具有特异性强、敏感性高、稳定性好,可以实现临床样本中AHSV抗体的检测,因此可以作为AHS血清学监测的一种有效工具。

非洲马瘟病毒VP7基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

为了获得具有天然活性的非洲马瘟病毒重组VP7蛋白,制备针对非洲马瘟VP7蛋白的单克隆抗体及建立快速抗体检测方法,本试验通过PCR扩增、胶回收纯化后经XbaⅠ和HindⅢ特异性酶切,将VP7基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB,经PCR、酶切、测序鉴定后,成功构建了携带VP7基因的重组质粒pFastBacHTB-AHSV-VP7。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒Bacmid-AHSV-VP7,并在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染Sf9昆虫细胞,收获表达产物。表达产物经Western blotting分析表明,VP7重组蛋白得到表达,其分子质量大小约为45ku,且具有良好的生物活性。

非洲马瘟病毒群特异性RT-PCR检测方法的研究

非洲马瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)为双股RNA病毒,感染所有马科动物。设计2对位于AHSV基因组S7片段的引物,经RT-PCR扩增,证实2对引物对6种血清型的AHSV RNA均有特异性扩增,且能对同属的蓝舌病病毒(BTV)、鹿出血热病毒(EHDV)进行区别诊断。经序列测定及Blast,证实所扩增的条带确为AHSV S7相应位置核苷酸序列,表明已初步建立AHSV群特异性RT-PCR检测方法。

非洲马瘟病毒分型RT-PCR检测方法的研究

为验证所引进9个血清型的非洲马瘟病毒,并同时对其分型鉴定方法有所探索,根据参考文献设计位于AHSV基因组L2片段的型特异性分型引物,用RT-PCR及测序方法进行实验研究。抽提所引进9种血清型的RNA,经RT-PCR扩增,各引物均有特异性扩增,经进一步的核苷酸序列测定及分析,证实所扩增片段均为非洲马瘟病毒L2基因相应位置片段;同时对AHSV分型RT-PCR检测方法进行了改进优化研究。实验证实分型引物对各RNA均有特异扩增,所引进9个血清型为正确血清型,并建立了适合实验室条件的AHSV分型鉴定方法。

非洲马瘟病毒实时荧光RT-RPA快速检测方法的建立

本研究根据非洲马瘟病毒(AHSV)S7基因保守序列设计特异性引物和探针,建立了检测AHSV的实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)方法。该方法特异性强,仅AHSV检测为阳性,蓝舌病病毒(BTV)、马流感病毒(EIV)、马动脉炎病毒(EAV)等病原检测均为阴性;灵敏性高,最低检出限为2.36×10^(1)copies/μL;反应快速,检测时间为20 min,同时具有良好的重复性。利用该方法和实时荧光RT-PCR平行检测60份临床样品,符合率为100%。结果表明,本研究建立的AHSV RT-RPA检测方法特异、敏感、快速且结果可靠,适用于AHSV的高通量、快速检测。

非洲马瘟病毒和西尼罗病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立一种可同时检测非洲马瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)和西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)的双重荧光定量RT-PCR检测方法。根据AHSV VP 7基因序列和WNV Poly Protein基因的高度保守区域设计特异性引物和探针,优化反应条件及体系,绘制标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行测定,并采用该方法对临床样品进行检测验证。结果显示:该方法能够同时检测AHSV和WNV,且特异性良好,与马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马传染性贫血病毒、马腺疫链球菌、马流感病毒等马病核酸均无交叉反应;敏感性高,AHSV和WNV最低检测限均为10 copies·μL^(-1);组内变异系数为0.04%~0.93%,组间变异系数为0.17%~4.83%,重复性良好;使用该方法对30份马全血样品进行检测,结果均为阴性。本试验建立的检测方法对马属动物检疫、非洲马瘟和西尼罗热的监测与防控具有重要意义。

非洲马瘟病毒(AV1311株)核糖核酸标准物质的研制

标准物质是分子生物学诊断技术的金标准。针对国内无非洲马瘟病毒标准物质的现状,以其AV1311株为原料,通过病毒培养、灭活、分装、特性检验等,成功制备非洲马瘟病毒(AV1311株)核糖核酸标准物质。同时,建立数字PCR方法,对标准物质进行均匀性评估、稳定性考察及9家实验室联合定值,并进行临床试用。结果显示,组内和组间无统计学差异,样品均匀;-20℃保存可稳定6个月,4℃保存可稳定7 d,25℃保存可稳定24 h,可冻融5次,需干冰运输;标准物质认定值为(6.9±1.1)×10^(3)copis/μL;临床试用显示,所制备的标准物质与临床样品互通性良好;最终通过全国标准物质管理委员会评审,获得国家二级标准物质证书[GBW(E)091272]。综上,本标准物质定值准确,均匀性好,量值稳定,为做好国内非洲马瘟防范工作提供了物质基础。

非洲马瘟病毒VP7蛋白的可溶性表达及抗体阻断ELISA方法的初步建立

为了实现非洲马瘟病毒(AHSV)VP7蛋白的可溶性表达,制备其特异性单克隆抗体,建立AHSV VP7阻断ELISA抗体检测方法,通过对编码AHSV VP7蛋白的基因序列进行突变设计与密码子优化,以大肠杆菌表达系统表达可溶性VP7蛋白并进行纯化,免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得VP7蛋白单克隆抗体。通过细胞免疫荧光和Western-blot鉴定单克隆抗体的特异性,并建立AHSV VP7阻断ELISA方法。结果显示,利用大肠杆菌表达系统成功表达了可溶性重组AHSV VP7蛋白,将纯化的VP7蛋白免疫小鼠筛选制备了2株稳定分泌VP7蛋白单克隆抗体的细胞株,分别为3F7和7H8。经鉴定证明这2株VP7单克隆抗体不仅能与大肠杆菌重组表达的VP7蛋白反应,而且也与BHK-21细胞表达的具有天然构象的重组VP7蛋白反应,具有良好的特异性和反应性。以重组VP7蛋白和单克隆抗体7H8分别为包被抗原和阻断抗体建立了AHSV VP7阻断ELISA方法,检测了277份马血清样本,结果与商品化进口AHSV抗体检测试剂盒测定结果一致。本研究在大肠杆菌表达系统中实现了AHSV VP7蛋白的可溶性表达,制备获得了VP7特异性单克隆抗体,并建立了AHSV VP7阻断ELISA方法,为我国有效防控非洲马瘟的传入提供了技术储备。

非洲马瘟病毒VP5蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及其抗体制备

为了确定非洲马瘟病毒(AHSV)VP5蛋白的免疫学特性,通过人工合成非洲马瘟病毒VP5蛋白的S6全长基因序列,经PCR扩增后克隆到转座质粒载体pFastBac HTb上,将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑试验筛选出重组杆状病毒质粒Bacmid-AHSVS6,转染Sf9昆虫细胞;构建了重组质粒pFastBac-AHSVS6,拯救获得含有AHSV S6基因的重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western-blot鉴定表明,在Sf9昆虫细胞中成功表达分子质量大小为60 ku的AHSV VP5重组蛋白。采用组氨酸标签纯化树脂对重组VP5蛋白进行纯化,将其与弗氏佐剂乳化后3次免疫新西兰大白兔收集血清,获得了针对AHSV VP5蛋白的多克隆抗体,并通过Western-blot和间接免疫荧光试验验证了该抗体的特异性。本试验利用杆状病毒表达系统成功表达了AHSV全长VP5重组蛋白,成功制备出特异的VP5蛋白多克隆抗体,这为进一步研究AHSV VP5蛋白的功能及研制亚单位疫苗奠定了基础。

非洲马瘟病毒NS1蛋白在昆虫细胞中的表达及抗原性分析

非洲马瘟(African horse sickness,AHS)是一种由媒介昆虫传播感染马属动物的病毒性疾病,为了在杆状病毒表达系统中表达AHSVNS1蛋白并评估其作为亚单位疫苗组分的抗原性,本研究参考GenBank上公布的AHSV基因序列,人工合成NS1全长基因序列,利用PCR方法扩增完整的开放阅读框后将其克隆到转座载体pFastBacTMHTb上,将成功构建的重组质粒pFastBac-AHSVNS1转化到DH10Bac感受态细胞中,获得了含有AHSVNS1基因的重组杆粒Bacmid-AHSVNS1,将其转染到Sf9昆虫细胞内获得了表达AHSVNS1蛋白的重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western-blot结果显示,表达的重组AHSV NS1蛋白大小为65 ku,且获得了纯化的重组AHSV NS1蛋白。将其免疫BALB/c小鼠,细胞免疫荧光和Western-blot试验显示获得了特异性的抗AHSV NS1蛋白多克隆抗体,其效价达1∶51 200。流式细胞分析显示,AHSV NS1蛋白免疫小鼠能够刺激CD4+和CD8+T淋巴细胞的增加。上述研究结果表明,AHSV NS1蛋白作为AHSV亚单位疫苗的组成成分具有一定应用前景。本试验实现了AHSV NS1蛋白在昆虫细胞中成功表达并验证其具有良好的抗原性,这为进一步研究AHSV NS1蛋白的生物学功能和亚单位疫苗开发奠定了基础。

非洲马瘟病毒VP2蛋白的截短表达及免疫原性分析

为评价非洲马瘟病毒(AHSV)VP2截短蛋白的免疫原性,以人工合成的含有AHSV S2的全长基因为模板,分别构建重组表达质粒p RSF-S2-502(编码1~502 aa)和p RSF-S2-1056(编码503~1056 aa),分别将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达。将纯化后的重组蛋白免疫小鼠后,采用间接ELISA测定小鼠血清中特异性抗体水平,用流式细胞术检测小鼠脾T细胞亚群、CD4^(+)和CD8^(+)T细胞表达IFN-γ的水平。结果显示,与PBS对照组相比,各免疫组小鼠血清中特异性抗体水平均显著升高,脾内CD4^(+)T和CD8^(+)T细胞水平均显著升高;免疫组小鼠脾CD4^(+)T和CD8^(+)T细胞表达IFN-γ的水平均升高。结果表明,重组AHSV VP2截短蛋白对小鼠具有较好的免疫原性,为进一步研究VP2蛋白生物学功能及非洲马瘟病毒亚单位疫苗奠定了理论基础。