两株马立克病毒的分离鉴定及其主要致病基因分析

为了解国内鸡群马立克病毒(MDV)流行毒株的分子特征,采用细胞培养法对马立克病疑似病鸡抗凝血进行MDV分离,间接荧光法鉴定MDV血清型,PCR扩增分离病毒的meq和pp38两个主要致病基因,所得序列与MDV参考毒株的序列进行比对分析。结果显示,共分离鉴定出2株MDV I型毒株,分别命名为JS0316和JS0424。meq基因编码的氨基酸序列结果显示,2个MDV分离株缺乏弱毒疫苗株的特征(A71S、P194-),具有MDV强毒分离株的分子特征(D80Y、V115A、T139A、P176R和P217A)。同时,JS0316 Meq蛋白出现Q93R和V123A突变,pp38蛋白出现L98I和F240S突变,而JS0424 Meq蛋白出现P217T突变,pp38蛋白出现W67G和V210A突变。因此,2株MDV均具有国内流行强毒株的分子特征,同时存在新的基因突变。

不同鸡马立克病疫苗的免疫保护效果比较

【目的】对国内外共7个批次/品种(A~D,F~H)的CVI988或CVI988+HVT商品疫苗进行免疫保护分析,以期了解不同马立克病(MD)疫苗的保护效果,为该病的防控提供参考。【方法】将140只1日龄SPF鸡随机分为9组,G01~G09组,其中G01~G07组(15只/组)分别按推荐剂量免疫A~D及F~H马立克病疫苗,G08(攻毒对照组,15只)和G09(空白对照组,20只)组不免疫,7日龄时G01~G08组分别经腹腔注射马立克病病毒(MDV)超强毒Md5株(1000 PFU/只),所有鸡隔离饲养120 d。通过检测疫苗毒蚀斑数、疫苗毒复制情况、攻毒后体重差异、临床表现和病理变化综合评估各疫苗的保护力。【结果】7个批次疫苗的病毒蚀斑数均符合国家标准(2000 PFU/羽份),疫苗F的病毒蚀斑数最高(6467 PFU/羽份)。以1羽份剂量免疫1日龄SPF鸡后,疫苗F的复制速率相对较快。用Md5株攻毒后,攻毒对照组鸡体重减轻,且有93.3%(14/15)的鸡死亡,100%(15/15)剖检出现MD典型病变;G01~G07各免疫组鸡体重与空白对照组鸡相比,均无显著差异(P>0.05),死亡比例分别为0/14、3/15、5/15、0/14、0/13、0/15和1/15,剖检出现MD典型病理变化的比例为5/14、8/15、7/15、5/14、3/13、3/15和5/15,攻毒保护试验结果显示,7个批次的马立克病疫苗对鸡均具有一定保护力,保护指数为45.7%~73.3%。【结论】不同厂家生产的鸡马立克病疫苗对MDV超强毒Md5株的攻击具有相似的保护效果,二价苗的保护力(73.3%)高于单价疫苗。

马立克病病毒PCR检测方法建立与应用

马立克病(Marek’s disease,MD)是由马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)感染引起的一种免疫抑制性疾病,引发感染鸡的T淋巴细胞组织增生和传染性肿瘤,是危害养禽业的主要免疫抑制病之一。MDV鸡体内发育成熟后,随着皮屑的脱落而进入外界环境中,通过水平传播感染其他鸡只,造成MD的流行。meq基因和病毒编码的端粒酶RNA与MDV直接致瘤相关,其中meq基因对MDV诱导的T淋巴细胞转化至关重要,故meq基因可导致MDV感染鸡T淋巴细胞瘤的形成。常规PCR方法,具有效率高、特异性强、敏感性高等优点,可用于MD的初步诊断和病毒鉴定。因此,建立一种能快速检测MDV的PCR方法对养禽业的健康发展具有重要意义。

鸡马立克氏病的病因和防控措施

马立克氏病(MD)是由马立克氏疱疹病毒(MDV)引起的一种病毒性传染病,该病分布范围广,在全世界养禽的国家几乎都有发生,给世界养禽业带来严重的危害。鸡、鹌鹑、山鸡等都可以感染MDV,但是鸡的易感性最强,对鸡群造成的危害最大。本文详细介绍了鸡马立克氏病的发病原因和防控措施,以期为做好该病的防控提供技术参考。

基于马立克病病毒Meq蛋白单克隆抗体的免疫组化诊断方法的建立

为了对临床上马立克病(MD)准确诊断,研究利用杆状病毒表达系统表达马立克病病毒(MDV)强毒株Meq重组蛋白免疫小鼠,利用杂交瘤技术研制MDV Meq蛋白特异性单克隆抗体,并以此为基础建立MD诊断方法。结果显示:试验成功制备了4株Meq蛋白特异性单克隆抗体,分别命名为MDV-Meq-1D6、MDV-Meq-1D10、MDV-Meq-6B3、MDV-Meq-6D10;Western blot结果证明这些单克隆抗体不仅能与体外表达的Meq蛋白反应,而且能识别MD肿瘤细胞系MSB-1中的Meq蛋白和MD肿瘤组织细胞中的Meq蛋白;以Meq蛋白单克隆抗体成功建立免疫组化诊断MD的方法,该方法特异性强,结果稳定,易观察判定。研究表明,试验制备了4株Meq蛋白单克隆抗体(MDV-Meq-1D6、MDV-Meq-1D10、MDV-Meq-6B3、MDV-Meq-6D10),基于此建立的免疫组化MD诊断方法为临床MD鉴别诊断提供技术支撑。

血清1型马立克氏病病毒单克隆抗体的制备及其特异性鉴定

为制备血清1型马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)单克隆抗体,以超速离心浓缩的血清1型MDV CVI988/Rispens毒株免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术制备单克隆抗体。通过亚克隆、间接ELISA和间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)筛选,获得3株分泌特异性抗血清1型MDV单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为4D9、1C5和1F10,并对其进行特异性分析。间接ELISA结果显示,4D9、1C5和1F10制备的腹水ELISA效价分别达5.1×10^(4)、82×10^(5)、4.1×10^(5),可用于后续建立ELISA检测方法;IFA结果显示,4D9、1C5和1F10制备的腹水与不同血清1型MDV毒株具有良好的反应性,效价可分别达1∶12800、1∶25600和1∶12800,与血清3型MDV毒株和其他常见禽源病毒均没有交叉反应,特异性良好;亚型检测结果显示,4D9抗体为IgG2a/κ型,1C5抗体为IgG2b/κ型、1F10抗体为IgG1/κ型;应用1C5建立的IFA方法能检出至少5PFU CVI988/Rispens毒株感染,适用于血清1型MDV的检测。综上,制备的单克隆抗体可用于血清1型MDV的检测,为MDV致病机制研究及诊断试剂研发提供基础。

基于网络药理学探讨艾草抗鸡马立克病毒的活性成分与作用机制

运用网络药理学方法探讨艾草抗鸡马立克病毒(Marek’s disease virus,MDV)的活性成分、作用靶点及可能的作用机制。利用TCMSP数据库检索艾草化学成分和作用靶点,查阅文献收集MDV相关宿主基因靶点,建立靶点数据库;利用STRING数据库结合Cytoscape 3.8.0软件构建靶点蛋白相互作用网络及活性成分-关键靶点网络,筛选核心靶点和主要活性成分;利用DAVID数据库对关键靶点进行GO功能分析和KEGG通路富集分析;最后利用分子对接技术验证主要活性成分与关键靶点的结合能力。结果显示,从艾草中筛选出8种活性成分,共有108个基因靶点与MDV宿主基因存在相互作用,艾草抗MDV作用的主要靶点有JUN、CCND1、CDK1、IL-6等;GO功能分析涉及细胞活性、炎症反应等过程,KEGG富集分析涉及C型凝集素受体信号通路、MAPK信号通路、细胞衰老、p53信号通路、细胞凋亡、Toll样受体信号通路等;异泽兰黄素与靶点蛋白CCND1的对接能力最强。结果表明,艾草主要活性成分异泽兰黄素可能是通过作用于CCND1,干预细胞周期影响细胞活性,进而发挥抗MDV效应。

鸡马立克氏病的诊断方法与防控建议

马立克氏病是鸡最常见的淋巴组织增生性疾病,其特征是形成外周神经及其他器官中的单核细胞浸润和肿瘤。鸡马立克氏病是由疱疹病毒引起的,具有高度传染性,其致病性与其他鸡淋巴肿瘤疾病不同。鸡马立克病的发病率和死亡率高,危害大,常继发鸡病原体,是一种急性传染病,马立克氏病破坏法氏囊、胸腺、脾脏等免疫器官,引起强烈的免疫抑制,并影响各种疫苗的预防效果。病鸡是鸡马立克氏病主要传染源,一旦感染可迅速在鸡群中散播,造成严重的经济损失,因此可以通过实施合理的马立克病诊断和监测方法,积极推广有效的综合防治措施,进一步降低马立克病对鸡造成的经济损失。本文就鸡马立克病给养禽业造成的损失,对鸡马立克病的病因、流行特点、诊断方法以及防控措施等进行了详细论述,以期为防治鸡马立克氏病提供积极有效的方案。

复方中草药对马立克氏病蛋鸡生产性能及血清生化指标的影响

为探究复方中草药对蛋鸡场马立克氏病鸡血清生化指标的影响,本试验挑选80只马立克氏病确诊鸡,随机分为四组,即对照组、试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组,分别给予0、100、200和300 mg/kg复方中草药制剂治疗。结果表明:与对照组相比,(1)试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组终测体重、平均日增重和平均日耗料量显著升高(P<0.05),产蛋率显著升高(P<0.05),料蛋比显著降低(P<0.05),马立克氏病鸡死亡率显著降低(P<0.05);(2)试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组的球蛋白、总蛋白和甘油三酯含量显著升高(P<0.05),谷丙转氨酶和谷草转氨酶显著降低(P<0.05)。综上所述,复方中草药可以有效改善马立克氏病蛋鸡的生产性能和血清生化指标,对马立克氏病有显著的治疗效果,且在本试验条件下复方中草药的最佳剂量为300 mg/kg。

鸡马立克氏病的流行特点及预防措施

鸡马立克氏病是由疱疹病毒感染引发的一种以外周神经、性腺、虹膜以及各脏器、皮肤等组织出现增生的传染性疾病。该病可在鸡群中广泛传播,具有较强的传染性,且致死率较高,主要为害4周龄以内的雏鸡,被感染的鸡会表现出渐进性消瘦、精神沉郁、神经症状等,严重影响鸡的正常生长,甚至导致大批量死亡。为避免养殖户因鸡马立克氏病造成严重的经济损失,笔者根据多年养鸡经验,综合分析了该病的流行特点及临床症状,并总结了一套预防方法,为养殖户预防鸡马立克氏病提供参考。

一例湘黄鸡马立克氏病的诊治

衡南县某湘黄鸡场暴发了以运动失调、两腿呈“劈叉”姿势、翅膀一侧或两侧下垂、扭头或仰头、拉黄白色或黄绿色稀粪等为主要特征的疾病,发病死亡率达27.7%。经病理剖检、实验室检测,结合临床症状,确诊为马立克氏病感染。通过采取综合防疫措施使疫病得到控制。

马立克病基因工程疫苗研究进展

马立克病(MD)是由马立克病病毒(MDV)感染引起的严重危害世界养禽业健康发展的一种重要的家禽免疫抑制病与肿瘤病,是人类历史上第一个可以通过疫苗免疫接种成功预防肿瘤疾病发生的案例。对雏鸡早期接种MD疫苗,可有效控制MD肿瘤的发生。随着MD疫苗的广泛使用和长期免疫压力,MDV流行毒株也在不断进化、毒力增强或变异,部分毒株已突破现有商品疫苗的免疫保护,导致MD疫情在全球频繁暴发。自MD疫苗问世至今,已有多种MD疫苗研制成功,并且二价疫苗、三价疫苗、重组载体疫苗、基因缺失或插入的MD疫苗等也在不断被研究和优化。利用各种新兴的生物学技术,如细菌人工染色体(BAC)、基因同源重组和CRISPR/Cas9基因编辑等来开展MD基因工程疫苗研究,已成为病毒病疫苗研究领域的最新热点。本文回顾了过去50年来MD疫苗研究历程及巨大成就,并全面综述了当前国内外MD基因工程疫苗和基因编辑疫苗所取得的最新研究进展,同时也对现有MD商品疫苗免疫预防所面临的新问题、新挑战和未来前景进行了展望,以期为下一代新型高效的MD疫苗创制提供重要参考。

鸡马立克氏病防控技术研究进展

鸡马立克氏病是危害养禽业最为严重的免疫抑制与肿瘤病,也是能用疫苗免疫的肿瘤病。本文针对最近五年我国鸡马立克氏病的流行变异、免疫防控与未来发展进行总结分析,以期为国内家禽养殖业、生物制品行业提供参考。

鸡马立克病毒meq基因克隆及遗传进化分析实验设计

该文设计了一个涉及兽医传染病学、兽医分子生物学等兽医学科专业的探索性实验——鸡马立克病毒meq基因克隆及遗传进化分析实验。实验内容包括通过全自动核酸提取仪、荧光定量PCR仪对鸡组织病料中马立克病毒核酸进行检测,在确定病毒核酸阳性的基础上通过分子生物学手段扩增特征毒力基因meq序列,通过与Genbank已报道的30多株参考毒株序列进行比对,分析该病例马立克病毒的分子特征及遗传进化特点。该实验可锻炼学生的实验动手能力,加深对兽医学相关内容的理解,激发对专业知识的兴趣。

一例鸡马立克氏病的诊断及其病毒Meq基因序列分析

为确定四川省乐山市某蛋鸡场病鸡的发病原因,该试验采用临床剖检、PCR方法对发病鸡进行诊断,并对病毒Meq基因全序列进行PCR扩增、测序和序列分析。剖检结果为病鸡心脏、肝脏和脾脏表面均有白色结节,PCR鉴定结果为马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)阳性。MDV Meq基因全序列长度均为1020bp,核苷酸和氨基酸同源性分别为99.6%~99.9%和98.8%~100%,与MDV参考序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.4%~99.8%和95.9%~99.4%。4个Meq测序序列存在4个新的氨基酸突变位点,均具有D80Y、V115A、T139A、P176R和P217A氨基酸突变位点,符合MDV强毒株的序列特征。系统发育树显示4株乐山市分离毒株测序序列与近年国内大部分参考毒株聚在同一分支上,亲缘关系较近,未形成明显的地理分支,乐山MDV样品132bp重复序列的拷贝数及Meq基因的变异均符合MDV强毒株的序列特征,且存在新的氨基酸突变。

miR-M11基因编辑对马立克病病毒体外复制的影响

为探究病毒编码的微小RNA前体基因miR-M11对马立克病病毒(MDV)体外复制能力的影响,以MDV国内分离株HN_(3)0_(2)为研究对象,利用CRISPR/Cas9系统靶向编辑并敲除位于Mid基因簇的miRM11,构建1株miR-M11基因编辑缺失毒株HN_(3)0_(2)ΔM11(克隆号C58-8-4)。经过PCR鉴定、测序分析、间接免疫荧光试验(IFA)、实时荧光定量PCR(qPCR)以及传代稳定性分析,证实HN302编码的miRM11被精确编辑并从病毒基因组中完全缺失,且未发生回复突变。病毒增殖曲线绘制结果显示,miRM11缺失毒株HN_(3)0_(2)ΔM11的增殖速度显著高于亲本毒株HN_(3)0_(2)(P<0.05)。综上,miR-M11是MDV复制的非必需基因,且其缺失后可增强MDV的体外复制能力。

外源性马立克氏病病毒荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】为解决现有兽用生物制品外源性马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)检验方法灵敏度低、检测时间长、鉴别性不强的问题,研究分别建立MDV血清1型(MDV serotype 1,MDV 1)和MDV血清3型(MDV serotype 3,MDV 3)毒株的实时荧光定量PCR检测方法,用于禽用生物制品纯净性控制。【方法】从NCBI下载MDV 1、MDV血清2型(MDV serotype 1,MDV 2)和MDV 3各毒株UL19序列,进行核苷酸和氨基酸序列比对分析;分别针对MDV 1 CVI988毒株、MDV 3 FC126毒株的UL19设计特异性引物和相应的Taqman探针,建立实时荧光定量PCR检测方法;分别构建相应的重组质粒作为阳性标准品,建立标准曲线,并评价所建立方法基因拷贝数检测的灵敏度;分别对其他禽用病毒类生物制品、毒种、MDV 2 SB-1毒株UL19的全长质粒及生产原材料(SPF鸡胚尿囊液、胚体、尿囊膜、鸡胚成纤维细胞)进行检测,评价检测方法的特异性;分别对600、60、6、0.6、0.06、0.006、0.0006 PFU的CVI988毒株和FC126毒株进行检测,评价所建立方法检测活病毒粒子的灵敏度;分别以不同稀释度的阳性标准品质粒为模板,进行3次重复性检测,计算变异系数,分析所建立检测方法的可重复性。【结果】MDV UL19在同一血清型内核苷酸和推导的氨基酸同源性达99.99%,具有很高的保守性,在不同血清型间核苷酸同源性只有约75%,推导的氨基酸同源性只有约85%;分别建立了MDV 1和MDV 3两种实时荧光定量PCR检测方法;MDV 1检测方法标准曲线的扩增效率E=98.8%,相关系数R^(2)=0.992,标准曲线方程Y=-3.351X+38.828(Y=Ct,X=lg(拷贝数)),MDV 3检测方法标准曲线的扩增效率E=95.0%,相关系数R^(2)=0.998,标准曲线方程Y=-3.447X+36.496(Y=Ct,X=lg(拷贝数));所建立的两种检测方法特异性好,MDV 1或MDV 3毒株扩增曲线良好,其他禽用病毒类生物制品、毒种、MDV 2 SB-1毒株UL19的全长质粒及生产原材料未出现特异性扩增曲线;灵敏度高,MDV 1基因拷贝数检出限度为32.8拷贝/μL,至少可检出0.006 PFU的CVI988毒株,MDV 3基因拷贝数检出限度为10拷贝/μL,至少可检出0.006 PFU的FC126毒株;重复性好,MDV 1检测方法重复性试验的变异系数小于1%,MDV 3检测方法重复性试验的变异系数小于1.5%。【结论】所建立的实时荧光定量PCR检测方法可分别用于禽用生物制品中外源性MDV1、MDV3毒株的检测。

鸡马立克氏病疫苗的使用方法

鸡马立克氏病是严重危害养鸡业的主要传染病之一，由于该病至今没有有效的药物和治疗方法，疫苗接种是控制该病的主要手段。由于在疫苗使用中没有掌握正确的使用方法，常使鸡马立克氏疫苗免疫失败。本文将介绍如何在日常鸡只免疫中正确使用鸡马立克氏病疫苗。1疫苗的分类鸡马立克氏病毒分为3种血清型，每种血清型都有对应的疫苗。

鸡马立克氏病综合防治技术的研究

马立克氏病(MD)是由马立克氏病病毒(MDV)引起的一种危害鸡的恶性淋巴肿瘤性疾病又名内脏型淋巴瘤,俗称鸡麻痹症、白眼病,诱导各种组织器官以及神经发生单核细胞性浸润,往往造成重大的经济损失。发病鸡只常表现为严重消瘦、肢体麻痹,剖检可见肝脏与脾脏弥漫性肿瘤,单侧坐骨神经肿大。进一步的确诊可通过羽囊浸液琼脂扩散试验和PCR扩增试验。

血清Ⅱ型鸡马立克氏病毒的分离鉴定及SW14分离株pp24基因的序列分析

为了解鸡马立克氏病毒(MDV)在我国鸡群中的流行情况,本研究于2021年从福建省已免疫鸡马立克氏病(MD)疫苗鸡群且发生疑似MD病例的鸡场采集21份疑似发病蛋鸡外周血,分离其淋巴细胞接种鸡胚成纤维细胞(CEF),5 d后收集病毒,盲传1~2代后获得21株能够形成典型MDV蚀斑的分离株,依次命名SW1~SW21,采用PCR分别扩增MDV血清Ⅰ型(MDV-1) Meq基因、Ⅱ型(MDV-2) ORF873基因、Ⅲ型(MDV-3) US3基因进行MDV分型鉴定,扩增鸡传染性贫血病毒(CAV) VP3基因、禽网状内皮组织增殖病病毒(REV) LTR基因、禽白血病病毒A亚群(ALV-A)、B亚群(ALV-B)、J亚群(ALV-J)的env基因进行外源病毒检测,结果显示MDV-1均为阴性,MDV-2均为阳性,MDV-3阳性率为38.1%(8/21),未检测到外源病毒基因。在MDV-2分离株中选择SW14株进行pp24基因的PCR扩增,测序后与MDV-2参考株SB-1、301B/1、HPRS24的pp24基因进行基因序列比对分析,结果显示,SW14和SB-1株同源性(96.3%)最高。通过透射电镜观察SW14,可见分离株呈双环型,直径约110 nm,符合MDV病毒粒子形态特征。本研究证实该鸡场中存在MDV-2流行,可能会影响疫苗的免疫效果,但其致病性有待进一步研究。本研究从疑似发病蛋鸡中分离到新的MDV-2株,为我国MDV-2的研究提供重要参考依据,同时为我国MD疫情防控提供有价值的研究材料。