不同鸡马立克病疫苗的免疫保护效果比较

【目的】对国内外共7个批次/品种(A~D,F~H)的CVI988或CVI988+HVT商品疫苗进行免疫保护分析,以期了解不同马立克病(MD)疫苗的保护效果,为该病的防控提供参考。【方法】将140只1日龄SPF鸡随机分为9组,G01~G09组,其中G01~G07组(15只/组)分别按推荐剂量免疫A~D及F~H马立克病疫苗,G08(攻毒对照组,15只)和G09(空白对照组,20只)组不免疫,7日龄时G01~G08组分别经腹腔注射马立克病病毒(MDV)超强毒Md5株(1000 PFU/只),所有鸡隔离饲养120 d。通过检测疫苗毒蚀斑数、疫苗毒复制情况、攻毒后体重差异、临床表现和病理变化综合评估各疫苗的保护力。【结果】7个批次疫苗的病毒蚀斑数均符合国家标准(2000 PFU/羽份),疫苗F的病毒蚀斑数最高(6467 PFU/羽份)。以1羽份剂量免疫1日龄SPF鸡后,疫苗F的复制速率相对较快。用Md5株攻毒后,攻毒对照组鸡体重减轻,且有93.3%(14/15)的鸡死亡,100%(15/15)剖检出现MD典型病变;G01~G07各免疫组鸡体重与空白对照组鸡相比,均无显著差异(P>0.05),死亡比例分别为0/14、3/15、5/15、0/14、0/13、0/15和1/15,剖检出现MD典型病理变化的比例为5/14、8/15、7/15、5/14、3/13、3/15和5/15,攻毒保护试验结果显示,7个批次的马立克病疫苗对鸡均具有一定保护力,保护指数为45.7%~73.3%。【结论】不同厂家生产的鸡马立克病疫苗对MDV超强毒Md5株的攻击具有相似的保护效果,二价苗的保护力(73.3%)高于单价疫苗。

马立克病病毒PCR检测方法建立与应用

马立克病(Marek’s disease,MD)是由马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)感染引起的一种免疫抑制性疾病,引发感染鸡的T淋巴细胞组织增生和传染性肿瘤,是危害养禽业的主要免疫抑制病之一。MDV鸡体内发育成熟后,随着皮屑的脱落而进入外界环境中,通过水平传播感染其他鸡只,造成MD的流行。meq基因和病毒编码的端粒酶RNA与MDV直接致瘤相关,其中meq基因对MDV诱导的T淋巴细胞转化至关重要,故meq基因可导致MDV感染鸡T淋巴细胞瘤的形成。常规PCR方法,具有效率高、特异性强、敏感性高等优点,可用于MD的初步诊断和病毒鉴定。因此,建立一种能快速检测MDV的PCR方法对养禽业的健康发展具有重要意义。

基于马立克病病毒Meq蛋白单克隆抗体的免疫组化诊断方法的建立

为了对临床上马立克病(MD)准确诊断,研究利用杆状病毒表达系统表达马立克病病毒(MDV)强毒株Meq重组蛋白免疫小鼠,利用杂交瘤技术研制MDV Meq蛋白特异性单克隆抗体,并以此为基础建立MD诊断方法。结果显示:试验成功制备了4株Meq蛋白特异性单克隆抗体,分别命名为MDV-Meq-1D6、MDV-Meq-1D10、MDV-Meq-6B3、MDV-Meq-6D10;Western blot结果证明这些单克隆抗体不仅能与体外表达的Meq蛋白反应,而且能识别MD肿瘤细胞系MSB-1中的Meq蛋白和MD肿瘤组织细胞中的Meq蛋白;以Meq蛋白单克隆抗体成功建立免疫组化诊断MD的方法,该方法特异性强,结果稳定,易观察判定。研究表明,试验制备了4株Meq蛋白单克隆抗体(MDV-Meq-1D6、MDV-Meq-1D10、MDV-Meq-6B3、MDV-Meq-6D10),基于此建立的免疫组化MD诊断方法为临床MD鉴别诊断提供技术支撑。

马立克病基因工程疫苗研究进展

马立克病(MD)是由马立克病病毒(MDV)感染引起的严重危害世界养禽业健康发展的一种重要的家禽免疫抑制病与肿瘤病,是人类历史上第一个可以通过疫苗免疫接种成功预防肿瘤疾病发生的案例。对雏鸡早期接种MD疫苗,可有效控制MD肿瘤的发生。随着MD疫苗的广泛使用和长期免疫压力,MDV流行毒株也在不断进化、毒力增强或变异,部分毒株已突破现有商品疫苗的免疫保护,导致MD疫情在全球频繁暴发。自MD疫苗问世至今,已有多种MD疫苗研制成功,并且二价疫苗、三价疫苗、重组载体疫苗、基因缺失或插入的MD疫苗等也在不断被研究和优化。利用各种新兴的生物学技术,如细菌人工染色体(BAC)、基因同源重组和CRISPR/Cas9基因编辑等来开展MD基因工程疫苗研究,已成为病毒病疫苗研究领域的最新热点。本文回顾了过去50年来MD疫苗研究历程及巨大成就,并全面综述了当前国内外MD基因工程疫苗和基因编辑疫苗所取得的最新研究进展,同时也对现有MD商品疫苗免疫预防所面临的新问题、新挑战和未来前景进行了展望,以期为下一代新型高效的MD疫苗创制提供重要参考。

miR-M11基因编辑对马立克病病毒体外复制的影响

为探究病毒编码的微小RNA前体基因miR-M11对马立克病病毒(MDV)体外复制能力的影响,以MDV国内分离株HN_(3)0_(2)为研究对象,利用CRISPR/Cas9系统靶向编辑并敲除位于Mid基因簇的miRM11,构建1株miR-M11基因编辑缺失毒株HN_(3)0_(2)ΔM11(克隆号C58-8-4)。经过PCR鉴定、测序分析、间接免疫荧光试验(IFA)、实时荧光定量PCR(qPCR)以及传代稳定性分析,证实HN302编码的miRM11被精确编辑并从病毒基因组中完全缺失,且未发生回复突变。病毒增殖曲线绘制结果显示,miRM11缺失毒株HN_(3)0_(2)ΔM11的增殖速度显著高于亲本毒株HN_(3)0_(2)(P<0.05)。综上,miR-M11是MDV复制的非必需基因,且其缺失后可增强MDV的体外复制能力。

马立克病病毒单克隆抗体库构建及gB蛋白特异性单抗的筛选与鉴定

马立克病(MD)是由马立克病病毒(MDV)感染引起的危害最严重的一种家禽免疫抑制病与肿瘤病,制备MDV单克隆抗体可为后续的基因功能、致病机制及诊断技术研究提供关键试剂。本研究利用NE-PER TM细胞核和细胞质提取试剂,分别制备了vvMDV(MDV超强毒株)标准毒株Md5感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)核蛋白和浆蛋白,通过切向流超滤浓缩后制备免疫原,分别免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠,常规细胞融合方法制备单克隆抗体杂交瘤细胞。通过间接免疫荧光试验(IFA)筛选,建立了一个容量为31株纯化的MDV单克隆抗体杂交瘤细胞库,包括27株稳定分泌MDV-1特异性抗体和4株稳定分泌MDV-1、MDV-2和火鸡疱疹病毒(HVT)保守抗体的杂交瘤细胞株。经过293T细胞真核表达gB蛋白并结合IFA染色,其中1株单克隆抗体J-1F3-C6被鉴定为MDV糖蛋白gB的特异性单克隆抗体,其单抗腹水IFA效价为1∶25600,轻链型为Kappa,IgG亚型为IgG2a。进一步IFA染色表明,J-1F3-C6可特异性识别MDV-1、MDV-2和HVT毒株表达的gB蛋白,但在蛋白质免疫印迹(Western blot)分析中J-1F3-C6只与MDV-1和HVT发生特异性反应。综上,本研究建立了一个MDV单克隆抗体杂交瘤细胞库,并从中筛选鉴定了1株gB蛋白特异性的单克隆抗体,为后续研究奠定了重要基础。

鸡马立克病肺组织肿瘤病变与热休克蛋白表达的相关性分析

为探讨马立克病毒(Marek’s disease virus, MDV)与肿瘤发生、发展的关系,本研究建立了鸡马立克病(Marek’s disease, MD)模型,并利用病理组织学、免疫组织化学、荧光定量PCR、酶联免疫吸附(ELISA)等方法测定了肿瘤相关蛋白热休克蛋白60(heat shock protein 60, HSP60)在鸡肺脏组织内的定位及转录水平和含量的动态变化。结果显示,HSP60在攻毒组鸡肺脏肿瘤细胞的细胞质内强表达,试验周期内攻毒组HSP60 mRNA转录水平极显著高于对照组(P<0.01),总体呈开口向下的抛物线型,即7~28日龄间持续升高,28日龄达到最高值,分别为空白对照组和疫苗对照组的1.39倍和1.44倍,之后降低;HSP60含量7~28日龄攻毒组极显著高于空白对照组(P<0.01),35日龄后两者间差异不显著。该结果为进一步研究HSP60在肿瘤发生过程中的生物学作用奠定了基础。

一例鸡马立克病继发曲霉菌感染的实验室诊断

鸡马立克病是由鸡马立克病病毒(MDV)引起的一种高度接触性传染病,是鸡最常见的淋巴组织增生性疾病。尽管马立克病疫苗已经应用了40多年,但是本病仍然在世界各地传播,常常造成严重的经济损失。本病主要侵害3~5月龄鸡,死亡率最高可达60%以上。由于本病破坏鸡的法氏囊、胸腺、脾脏等免疫器官,造成严重的免疫抑制,所以感染鸡群对其它病原微生物的敏感性增高,并影响到其它疫苗的免疫效果。最近我们发现1例鸡马立克病继发曲霉菌感染病例,现报告如下:

马立克病病毒囊膜糖蛋白E基因的克隆及序列分析

用聚合酶链式反应 (PCR)技术 ,从中国广西分离的马立克氏病病毒 (MDV)N株和G2 株基因组DNA中 ,扩增出MDV糖蛋白E(gE)抗原基因片段的 1 5 0 0bp编码序列。将PCR扩增产物在KpnⅠ和HindⅢ位点克隆进 pUC1 8质粒载体中 ,以Dig标记的gEPCR产物作为探针做斑点杂交及酶切分析筛选到含MDVgE基因的目的重组质粒 pMNE、pMG2 E。通过酶切位点分析显示 ,两毒株的 gE基因内部酶切位点与MDV GA国际标准强毒株的酶切位点基本一致。对重组 pMNE、pMG2 E质粒进行部分序列测定 ,并用DNAStar软件分析 ,结果表明 :插入序列与发表的GA株gE基因序列具有高度同源性 ,gE基因为高度保守基因。

鸡马立克病的临床类型及预防

鸡马立克病由马立克病毒感染引发,主要导致感染部位发生瘤变,同时机体免疫力出现下降,病鸡发病严重程度受感染日龄、免疫力强弱、品种差异、病毒的毒力和数量、环境、性别以及饲养密度等因素的影响;根据感染部位的不同,本病分为神经型、眼型、内脏型、皮肤型四种类型,雏鸡发病率显著高于成年鸡,病死率接近100%,目前还没有特效药物能够治疗,发病鸡群建议全群淘汰为主,临床危害巨大;本文通过对病毒的特征分析详述了具体预防措施,以期为广大养鸡朋友带来帮助。

马立克病毒感染鸡端粒酶活性的研究

对1日龄非免疫鸡分别接种马立克病病毒(MDV)Ⅰ型国际标准强毒GA株、国内标准强毒京1株及Ⅰ型MDV疫苗毒CVI988株后第5d起,用改进的TRAP法和Bandscan软件测定分析、计算感染过程中鸡外周血淋巴细胞(PBMC)的端粒酶活性。结果,自接种MDVⅠ型强毒GA株和京1株后,在鸡尚未出现临床症状和可视病变之前端粒酶就可被检测到,并且随着感染鸡日龄的增加逐渐升高,分别在20～25日龄时其相对活力达到最高值;接种MDVCVI988后,整个试验期端粒酶活性均呈阴性。试验结果表明,MDVCVI988疫苗株具有较可靠的免疫效果,PBMC端粒酶活性与马立克病的发病进程具有一定的相关性。

鸡马立克病研究进展

鸡马立克病是由马立克病病毒引起的一种淋巴细胞增生性传染病,通常以外周神经和包括虹膜和皮肤在内的其他各种器官和组织的单核细胞浸润为特征。目前,仍然严重威胁着养禽业的发展,疫苗虽然可以预防马立克病的发生,但免疫失败时有发生,常常导致本病的局部暴发。论文对该病的病原、流行病学、临床症状、病理变化、发病机理、诊断及防控等方面进行了综述。

马立克病病毒致瘤相关基因的研究进展

从meq基因、pp38复合体、HSV ICP4的同源体、L开放阅读框(L ORF)、位于BamHⅠ-H片段的基因和病毒类白细胞介素-8(vIL-8)等几个方面论述了马立克病病毒感染期间参与肿瘤形成的相关基因的生物学活性。

两株马立克病病毒的分离及相关致病基因序列的比较

为了解国内鸡群马立克病（MD）流行毒株的遗传特征,采用细胞培养、间接免疫荧光等方法从江苏省2个鸡场送检病鸡中分离鉴定出2株马立克病病毒（MDV）Ⅰ型毒株,采用PCR方法扩增两分离毒株的vIL-8、pp38、meq等病毒致病相关基因,所得序列用DNAStar软件与GenBank上登录的参考毒株进行比较分析。结果显示,两分离毒株的序列同源性为99.7%-100%,与MDVⅠ型强毒及超强毒株的同源性为99.3%-99.8%,具有强毒特征;两分离毒株的meq基因与其他4个国内分离强毒株的序列完全一致,在pp38基因编码的氨基酸序列中第109位均为甘氨酸而不是国外GA等毒株的谷氨酸,这与以前报道的另外3个中国野毒株一致。提示,这些变异可能是国内MDV流行强毒的遗传性特征。

鸡马立克病病毒强毒与疫苗毒PCR鉴别检测方法的建立

在Ⅰ型马立克病病毒（MDV）基因组中针对132 bp串联重复序列的两侧合成一对引物,应用PCR技术对临床病例采集的疑似马立克病肿瘤病变鸡肝组织和1日龄接种CVI988弱毒疫苗的健康雏鸡羽髓样本进行检测。结果表明,从临床病例采集的10份肝脏组织,7份扩增出一条314 bp的条带,相当于2个拷贝数的132 bp串联重复序列;在接种疫苗健康雏鸡的羽髓样本中,扩增出与CVI988弱毒一致的PCR图谱,相当于6个~8个或更多拷贝数的132 bp串联重复序列。根据PCR图谱的差异即可鉴别MDV强毒株与CVI988疫苗弱毒株。

马立克病病毒与禽网状内皮增生病病毒的混合感染及在传代过程中的重组

旨在了解国内鸡群马立克病病毒(MDV)和禽网状内皮增生病病毒(REV)的混合感染及自然重组状况,探讨两种病原的基因重组对MDV病原学特性的潜在影响及危害。利用PCR扩增、序列测定及间接免疫荧光试验(IFA),对来自河南商品蛋鸡群的17个MDV分离株进行研究。结果表明,其中两个毒株HNGS206和HNXZ103的病毒基因组中存在REV—LTR的重组插入。进一步的IFA结果显示,HNGS206和HNXZ103并非MDV与REV的自然重组流行毒株,这两个毒株基因组中LTR的插入发生于临床病例鸡混合感染后的病毒分离及传代培养过程中。结果提示,虽然目前国内鸡群中MDV和REV的混合感染较为普遍,但MDV与REV自然重组毒株的流行状况仍需要进一步的流行病学监测。

马立克病病毒感染鸡心组织肿瘤病变与热休克蛋白表达的相关性分析

通过人工感染建立鸡MD肿瘤模型,研究鸡心病理组织学损伤、热休克蛋白(HSP)组织细胞定位以及HSPs表达水平的动态变化,探讨其相关性。1日龄,攻毒组肌肉注射0.2mL MDV液(约1 200PFU),疫苗免疫对照组进行常规MD疫苗注射免疫,于7、14、21、28、35、42及86日龄剖杀试验鸡,利用组织学、免疫组织化学和ELISA等方法,检测心病理组织学损伤、HSPs组织细胞定位以及HSPs表达水平的动态变化。结果如下:在MDV攻毒14d后,心组织可见大小不等的淋巴样瘤细胞浸润;HSP90主要分布在心肌纤维之间的肿瘤细胞胞质内,HSP70主要分布于心肌纤维胞质中;攻毒组HSP90含量始终高于空白对照组和疫苗对照组,28日龄后差异极显著(P<0.01),86日龄时约为两对照组的4.021和3.746倍;攻毒组HSP70含量呈现阶段性升高,35日龄时差异极显著(P<0.01),整个试验周期内,空白对照组和疫苗对照组HSPs表达量差异不显著。HSP90的组织细胞内定位与肿瘤细胞显著相关,主要位于肿瘤细胞胞质内,整个试验周期HSP90表达量显著高于对照组,有望成为鸡MDV引起的肿瘤疾病发生、发展的判定指标之一。