马羊膜上皮细胞分离、培养及影响因素的研究

为了建立马羊膜上皮细胞(equine amniotic epithelial cells,e AECs)的分离、培养方法,并对其影响因素进行研究,试验从胎盘剥离羊膜,采用Trypsin-乙二胺四乙酸(EDTA)或Tryp LE消化法分离获得上皮细胞,然后进行上皮细胞培养传代研究。结果表明:通过0.25%Trypsin-EDTA消化,每克羊膜平均获得2.2×106个细胞,其3代传代倍增时间平均为(1.32±0.21)d;通过0.25%Tryp LE消化,每克羊膜平均获得1.9×106个细胞,其3代传代倍增时间平均为(1.26±0.17)d,两者间差异显著(P<0.05)。Tryp LE消化结果比较稳定,更适合从马羊膜层消化、分离上皮细胞。

马羊膜上皮干细胞的分离培养和鉴定

通过Tryp LE消化马羊膜收集羊膜上皮细胞,经过传代培养后,用免疫荧光染色、RT-PCR及流式细胞技术(FACS)分析其干细胞特征。免疫荧光染色发现马羊膜上皮细胞表达SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81,只有少量的半贴壁细胞表达Oct4;RTPCR进一步证实马羊膜上皮细胞表达Oct4、Nanog和Sox2,而不表达STAT-3;流式细胞技术分析显示马羊膜上皮细胞也表达CD44、CD90、CD105,但不表达CD45。马羊膜上皮细胞培养三代时,平均倍增时间为(1.25±0.17)d。研究结果表明,通过Tryp LE消化马羊膜上皮可以分离获得马羊膜上皮细胞。