陕西马铃薯卷叶病病原的分子生物学鉴定

【目的】对陕西榆林疑似感染马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)的病株毒源进行分子生物学鉴定,为陕西省马铃薯卷叶病的防治提供参考。【方法】根据GenBank数据库已报道的马铃薯卷叶病毒外壳蛋白(Coat protein,CP)基因序列设计了1对引物,利用RT-PCR技术成功扩增了陕西PLRV.CP基因,然后进行克隆、测序,并与GenBank中已报道的27个PLRV分离物的CP基因进行同源性分析。【结果】获得的陕西PLRV.CP基因大小为627 bp,含有1个ORF,编码208个氨基酸的多肽,其与已报道的27个国内外PLRV.CP高度同源。【结论】陕西榆林的疑似病株确定为感染PLRV的马铃薯病株。

用逆转录—聚合酶链反应检测马铃薯卷叶病毒

用逆转录—聚合酶链反应检测马铃薯卷叶病毒张彤，哈斯阿古拉，张鹤龄，刘莉（内蒙古大学生物工程中心，呼和浩特，０１００２１）关键词卷叶病毒，反转录－ＰＣＲ，诊断马铃薯卷叶病毒（Ｐｏｔａｔｏｌｅａｆｒｏｌｌｖｉｎｉｓ，ＰＬＲＶ）属黄化病毒组（Ｌｕｔｅｏｖｉ...

马铃薯卷叶病毒云南分离物外壳蛋白基因的克隆与序列分析

With designed specific primers based on Potato leafroll virus(PLRV) coat protein(CP) gene sequence,one PCR fragment(about 0.6 kb) was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) using the total RNA as template extracted from virus infected potato plant collected in Zhaotong,Yunnan province.The fragment was cloned into pGEM-T easy vector and sequenced.The sequence was compared with that of homologous gene of other PLRV isolates.The results showed it had high homology with the other isolates(the highest homology reached 99.2% of nucleic acid).Based on CP amino acid sequence the phylogenic tree of PLRV was established and the isolates were clustered into many groups.

重组CP多克隆抗体在马铃薯卷叶病毒DAS-ELISA检测中的应用

先经过饱和硫酸铵沉淀分离,再用Protein G亲和层析柱纯化,从马铃薯卷叶病毒(PLRV)重组CP作抗原制备的抗血清中获得了高纯度多克隆抗体(IgG),并用戊二醛法一步法进行碱性磷酸酶的标记获得了酶标抗体(IgG-AP)。将纯化的抗体与酶标抗体用于感染PLRV病叶的检测,DAS-ELISA反应呈阳性,结果表明,用重组CP制备的多克隆抗体可成功地用于PLRV的DAS-ELISA检测。本研究为PLRV重组CP多克隆抗体的大量制备及ELISA检测奠定了基础。

马铃薯卷叶病毒RT-LAMP检测方法的建立

为建立一种快速准确检测马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus,PLRV)的方法,本研究以PLRV CP(coat protein,CP)基因ORF3保守序列为靶标,建立了PLRV反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测体系,并对建立的RT-LAMP检测体系的特异性、灵敏度、实际应用效果进行评估。结果表明,建立的PLRV RT-LAMP检测方法,在62℃恒温下扩增50 min,扩增产物中加入双链嵌合荧光染色(SYBR GreenⅠ),阳性样品颜色变为绿色,阴性样品颜色仍为褐色,可直接目测判断待检测样品是否感染PLRV。该方法只特异性检测PLRV,不与马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯A病毒(PVA)和马铃薯M病毒(PVM)等其他5种马铃薯主要病毒发生交叉反应。此外,建立的PLRV RT-LAMP检测方法的灵敏度较反转录PCR(RT-PCR)方法高100倍。田间样品检测验证,该方法与标准RT-PCR方法符合率达100%。本研究建立的以SYBR GreenΙ为颜色指示的PLRV可视化检测RT-LAMP方法,特异、灵敏、便捷,成本低,可满足科研、基层单位对该病毒快速诊断和检测的需要。

特异切割马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的核酶研究

根据锤头状核酶的作用模式，设计、合成并克隆了特异性切割马铃薯卷叶病毒中国分离株（ＰＬＲＶ－Ｃｈ）复制酶基因负链ＲＮＡ的核酶序列。以体外转录的ＰＬＲＶ－Ｃｈ复制酶基因负链ＲＮＡ作为底物，与转录的核酶ＲＮＡ共同保温，以检测核酶对底物的体外切割作用。实验结果表明。

马铃薯卷叶病毒分离株外壳蛋白基因和17k蛋白基因的克隆及序列分析

从典型的马铃薯卷叶病毒病株中直接提取出植物总RNA ,根据PLRV外壳蛋白基因序列 ,设计合成了一对寡核苷酸引物 ,经RT -PCR法扩增出全长的cDNA片段 ,将其克隆到质粒pGEM - 3Zf (+)上 ,并进行了序列分析。结果表明 ,克隆的cDNA片段由 6 2 7个核苷酸组成 ,编码 2 0 8个氨基酸组成的理论分子量为2 3k的蛋白 ,与PLRV外壳蛋白的大小一致 ;此外克隆片段还含有一个不同于外壳蛋白基因的阅读框架 ,该框架由 46 5个核苷酸组成 ,编码 15 5个氨基酸组成的理论分子量为 17k的蛋白 ,与PLRV的 17k蛋白大小一致。与国外报道的几个株系相比 ,PLRV分离物的外壳蛋白基因及 17k蛋白基因的核苷酸同源率分别高达97 5 %～ 99 7%和 96 5 %～ 99 6 % ,由此推测的氨基酸同源率高达 97 6 %～ 99 5 %和 96 1%～ 99 4% ,说明所克隆的PLRV外壳蛋白基因和 17k蛋白基因具有高度的保守性 ,本研究克隆了PLRV分离物外壳蛋白和17k蛋白基因的序列 。

马铃薯卷叶病毒(PLRV)内蒙古分离物基因间隔区(IS)的克隆与序列分析

根据Genbank已报道马铃薯卷叶病毒(PLRV)基因组序列,分析其基因间隔区(IS)两端的保守区,自行设计、合成一对特异性引物,以PLRV内蒙古分离物总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到含PLRVIS的一段369 bp的cDNA,克隆于载体pBS-T中。重组质粒经PCR鉴定、酶切分析和核苷酸序列测定,并进一步与PLRV其他分离物的同源序列作比对。结果表明:克隆的PLRV内蒙古分离物的IS序列与其他全部已发表的13个全基因组中的IS核苷酸序列有很高的同源性,最高达到100%,平均为97.90%,高于这13个PLRV全基因组序列96.81%的同源性,说明IS序列不仅在PLRV的不同株系间比较保守,而且在PLRV的全基因组序列中也是相对保守的。研究结果预示,将IS构建成RNA干扰型结构导入马铃薯,将有可能获得抗PLRV多种株系且抗性更高的转基因植株。

马铃薯卷叶病毒基因间隔区的克隆及序列分析

根据已报道的马铃薯卷叶病毒基因组序列．设计合成一对特异性引物，以马铃薯卷叶病毒中国分离株（ＰＬＲＶ－Ｃｈ）的ＲＮＡ为模板，反转录合成ｃＤＮＡ第一条链，经ＰＣＲ扩增后克隆于ｐＵＣ１９质粒中，进一步用ＰＣＲ鉴定、限制酶切分析和序列分析，结果表明：ＰＬＲＶ－Ｃｈ基因间隔区由１９７个核苷酸组成，与国外报道的荷兰ＰＬＲＶ－Ｎ加拿大ＰＬＲＶ－Ｃ，澳大利亚ＰＬＲＶ－Ａ，苏格兰ＰＬＲＶ－Ｓ各株系核苷酸序列具有很高的同源性，同源率依次为９９％、９８％、９３％、９８％。

马铃薯卷叶病毒PLRV RT-LAMP检测方法优化

马铃薯卷叶病毒Potato leafroll virus(PLRV)是目前严重影响马铃薯产量与品质的主要病毒之一,给马铃薯产业造成巨大损失。本研究采用环介导等温核酸扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术建立PLRV的RT-LAMP检测方法。采取单因素变化试验,对RT-LAMP反应体系中多个因素包括引物组合、温度条件及Mg2+、betaine、Bst 3.0 DNA聚合酶、dNTPs、UNG、SYBR GreenⅠ和引物组合的浓度进行一系列试验和优化。采用RT-PCR检测方法进行平行比对试验,对优化后的RT-LAMP反应体系进行了验证。结果表明,最佳引物组合为P3,最适反应温度62℃,25μL反应体系中,Mg2+、betaine、Bst 3.0 DNA聚合酶和UNG的最佳终浓度分别为4 mmol/L、0 mmol/L、0.64 U/μL和0.08 U/μL,dNTPs的最佳用量为1μL(dATP、dGTP、dCTP各0.4 mmol/L,dUTP 1.2 mmol/L),SYBR GreenⅠ(20×)的最佳用量1μL,primer mix的最佳用量2.5μL(PLRV-FIP/BIP、PLRV-F3/B3和PLRV-LF/LB的浓度分别为0.8、0.2μmol/L和0.6μmol/L),RNA模板1μL(2 ng/μL),加DEPC-H2O至25μL,反应时间50 min。优化后的RT-LAMP检测结果与RT-PCR一致,且可视化判读结果。因此,建立的PLRV RT-LAMP检测方法为进一步开发RT-LAMP检测试剂盒及其实际应用奠定了基础。

马铃薯卷叶病毒复制酶基因5'端克隆及序列分析

马铃薯卷叶病毒（Ｐｏｔａｔｏｌｅａｆｒｏｌｖｉｒｕｓ，ＰＬＲＶ）是正链ＲＮＡ病毒，属黄化病毒组（Ｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓ）〔１〕，严格虫传，分布广泛，难以控制，侵染马铃薯能引起大面积减产，给马铃薯生产造成巨大损失。ＰＬＲＶ基因组全长６．０ｋｂ，有６个读...

马铃薯卷叶病毒基因间隔区转化的马铃薯抗病性研究

将本室合成、克隆的马铃薯卷叶病毒（ＰｏｔａｔｏＬｅａｆｒｏｌＶｉｒｕｓ，ＰＬＲＶ）中国分离株的基因间隔区（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＩＳ）双链ｃＤＮＡ以正、反向两种方式分别构建于转化载体ｐＲＯＫ２中，通过致瘤农杆菌介导，以马铃薯叶圆片为转化材料，转化马铃薯栽培品种Ｄｅｓｉｒｅ，获得了转基因植株。卡那霉素抗性分析和ＰＣＲ检测目的基因，证明ＰＬＲＶＩＳ双链ｃＤＮＡ已经整合到转基因马铃薯的染色体基因组中。将转基因植株移栽网棚用蚜虫接种ＰＬＲＶ，观察症状并用酶联免疫吸附测定（ＥＬＩＳＡ）检测转基因植株中ＰＬＲＶ含量。结果表明，表达ＰＬＲＶＩＳ正意和反意ＲＮＡ的转基因植株，接种病毒后表现无症状或症状轻微，ＰＬＲＶ平均滴度均较未转基因对照植株低。表达正意ＲＮＡ的转基因植株ＰＬＲＶ滴度降低４３％～７２％，表达反意ＲＮＡ的转基因植株ＰＬＲＶ滴度降低７２％～８６％，由此可见，表达ＰＬＲＶＩＳ反意ＲＮＡ的转基因马铃薯对ＰＬＲＶ抗性较强。

马铃薯卷叶病毒福建分离物的基因克隆与序列分析

依据马铃薯卷叶病毒外壳蛋白基因序列,设计合成了一对特异性引物,采用反转录-聚合酶链式反应扩增得到了PLRV福建分离物外壳蛋白基因,克隆并测定了其核苷酸序列,进行了同源性分析.依据PLRV外壳蛋白氨基酸序列建立了PLRV不同分离物的系统进化树.

马铃薯卷叶病毒的RT-PCR快速检测

根据马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物。从感染马铃薯卷叶病毒(PLRV)的马铃薯叶片中提取出病毒RNA,进行cDNA合成并运用RT-PCR技术进行体外扩增,得到一条长度约627bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致,而对照未得到任何产物。从而建立了快速灵敏的PLRV检测方法,为PLRV的防治及检测提供了有效手段。

青海省马铃薯卷叶病毒的RT-PCR法检测

根据马铃薯卷叶病毒(PLRV)外壳蛋白基因的保守序列设计了一对寡聚核苷酸引物,从田间自然感染PLRV的马铃薯病株中提取病毒总RNA,用反转录-聚合酶链式反应扩增出符合设计大小240bp的特异性产物,而对照没有任何扩增产物。建立了快速、准确检验PLRV的分子检测方法,为青海省马铃薯生产中卷叶病毒的检测和防治提供了有效手段。

马铃薯卷叶病毒陕西分离物外壳蛋白(CP)的生物信息学分析

目的分析预测马铃薯卷叶病毒(PLRV)外壳蛋白的理化性质及结构。方法应用DNA-MAN软件、ExPASy中的ProtParam工具,SignalP,LipoP程序,TMHMM,PSIPRED和3D-PSSM等方法,分析PLRV.CP的核苷酸基本特征、蛋白质理化性质、亲疏水性、可溶性、信号肽、跨膜结构域、二级结构、保守区域、三级结构等。结果陕西PLRV.CP,与已报道的PLRV.CP高度同源。蛋白序列分析显示无跨膜螺旋结构,不属分泌蛋白,是可溶的亲水性蛋白。二级结构主要为折叠和无规则卷曲,不含转角。三级结构保守区预测表明,该蛋白属于黄化病毒属外壳蛋白成员。结论对马铃薯卷叶病毒外壳蛋白的生物信息学分析为进一步研究其功能、探索抗病途径奠定了基础。

马铃薯卷叶病毒复制酶基因3'端克隆及序列分析

马铃薯卷叶病毒复制酶基因３端克隆及序列分析梁成罡哈斯阿古拉张鹤龄（内蒙古大学，呼和浩特市０１００２１）关键词马铃薯卷叶病毒，复制酶，基因克隆，ＰＣＲ马铃薯卷叶病毒（Ｐｏｔａｔｏｌｅａｆｒｏｌｖｉｒｕｓ，ＰＬＲＶ）属黄化病毒组（Ｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓ）...

马铃薯卷叶病毒中国株(PLRV-Ch)复制酶基因结构研究

用设计合成的两对特异性引物 ,以马铃薯卷叶病毒中国分离株PLRV ChRNA为模板 ,经反转录PCR扩增 ,将复制酶基因 3′端 0 .6kb和 5′端 1.2kb ,克隆于 pUC19中 ,分别构建了重组质粒pLR3和 pLR5,并分五段进行了序列分析。将获得的核苷酸序列及氨基酸序列与国外报导的四个PLRV分离株的相应区段的序列同源性进行了比较。结果表明具有高度同源性。文中对核苷酸序列中存在的可能移码序列和其下游的茎环结构或假节结构、以及特征性三次重复区及氨基酸序列中复制酶蛋白N端的碱性氨基酸序列以及C端区域中包括GDD在内的 8个特征序列进行了讨论。作者发现移码序列上游的三次重复的核苷酸序列可以形成连续折叠的互补双链区和发夹结构 ,这一结构可能和转译移码有关。此外PLRV复制酶蛋白N端部分氨基酸序列易变 ,而C端氨基酸序列十分保守 ,可能和复制酶功能有更重要关系。

蚜虫中携带马铃薯卷叶病毒检测方法的改进

马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)对马铃薯生产的危害极大,是一种极为重要的马铃薯病毒病。RT-PCR是马铃薯卷叶病毒检测较为常用的方法,该方法检测准确率高、成本低、适用范围广。但在实际生产中其检测对象多为染病植株,对PLRV传播的主要介体桃蚜(Myzus persicae)的检测,则由于蚜虫体积小、RNA提取难度大、成本高、且不能复检,因而在生产中不能被广泛使用。该研究以马铃薯感病植株和带毒蚜虫为材料,利用改进的RNA提取方法从它们中提取到PLRV的RNA,并以CP基因设计特异性引物,进行PCR检测。结果表明:该方法提取的RNA完整性好,可用于蚜虫中PLRV检测,且同样适用于对马铃薯感病植株的检测。另外,通过对田间有翅蚜和无翅蚜携带PLRV情况进行检测发现,无翅蚜PLRV检出率为100%,有翅蚜PLRV检出率也高达60%,证明该体系在生产中的实用性。该研究使用改进的RNA提取方法,提取蚜虫中RNA,并利用RT-PCR进行了PLRV检测,与以前的方法相比简单实用,可被应用于生产检测中。该研究结果为马铃薯生产中PLRV的防控提供了一种新的手段。

陕北地区马铃薯卷叶病毒的RT-PCR检测与序列分析

以陕北8个县（区）种植2-3代疑似带毒的马铃薯叶片为材料,用Trizol法提取马铃薯叶片总RNA,以已公布的马铃薯卷叶病毒外壳蛋白（CP）基因序列设计特异引物,通过RT-PCR扩增目的DNA片段,对CP基因进行克隆和测序,采用DNAstar软件分析序列的一致性。结果表明,从陕北8个县（区）马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致、长度为336 bp的目的片段,说明马铃薯均感染了卷叶病毒。陕北8个县（区）马铃薯卷叶病毒CP基因之间的序列一致性达99.6%以上,与国内外其他地区10个样品CP基因的序列一致性为96.2%-99.8%,表明马铃薯卷叶病毒的CP基因序列比较保守。