河北保定地区黄瓜花叶病毒与马铃薯Y病毒复合侵染叶用莴苣分子鉴定

利用RT-PCR方法对采集自河北保定地区的疑似叶用莴苣病毒病样品进行分子生物学鉴定,并构建系统发育进化树。结果表明,特异性引物CMV和PVY分别扩增得到大小为260、420 bp的单一条带;通过核苷酸序列Blast比对及系统进化树分析,河北保定地区叶用莴苣病毒分离物分别与印度番茄CMV分离物(MN514839.1)、印度马铃薯PVY分离物(JX945850.1)聚在同一分支上,同源性分别为95%、92%。本研究首次检测到河北保定地区叶用莴苣病毒病是由CMV与PVY复合侵染所致。

β-氨基丁酸诱导马铃薯Y病毒抗性及信号转导途径研究

马铃薯Y病毒(PVY)是目前马铃薯、烟草等作物生产过程中危害最严重的病毒病之一,严重影响作物产量和品质。为探究β-氨基丁酸(BABA)对植物PVY抗性的诱导作用,以烟草品种Samsun为试验材料,通过对叶面喷施BABA,探究BABA对烟草PVY抗性的诱导作用及信号转导途径。结果表明,叶面喷施BABA可有效诱导烟草对PVY的抗性,其中5 mmol/L BABA对烟草PVY抗性诱导效果最明显。与对照相比,对感染PVY的植株喷施5 mmol/L BABA可以使叶片明脉推迟3~4 d出现,同时抑制由PVY引起的茎部坏死程度,经qRT-PCR测定发现,在接种病毒第5、7、10、14天的植株中,BABA处理组对PVY表达量的抑制率相较于对照组分别达到98.70%、96.62%、98.40%、66.89%,病理症状观察结果与分子检测结果相符合。通过高效液相色谱外标法对样品提取液进行分析发现,5 mmol/L BABA处理可诱导烟草内源水杨酸(SA)含量的峰值出现时间早于PVY病毒表达量峰值的出现时间,并有效调节烟草植株内活性氧动态平衡。通过qRT-PCR和H_(2)O_(2)原位表征测定得出,BABA处理在激活防御体系时,通过抑制相关抗氧化酶CAT的基因表达量,使H_(2)O_(2)在植株内适量积累,可在诱导抗性的同时降低H_(2)O_(2)对植株的毒害作用。结果表明,BABA对PVY的抗性诱导与SA作为信号分子参与诱导植株防卫基因表达过程存在紧密相关性。

含氟异喹啉二酮衍生物的合成及其抗马铃薯Y病毒活性分析

为了探索更高抗植物病毒活性的新药物分子,采用较廉价的原料、较温和的反应条件合成了12个含氟基团异喹啉二酮衍生物,并采用半叶枯斑法对合成的目标化合物进行抗马铃薯Y病毒(PVY)活性测定。结果表明:含氟异喹啉二酮衍生物对马铃薯Y病毒(PVY)具有较好的抑制活性,其中化合物3e的治疗活性(43.5%)、保护活性(47.1%)、钝化活性(51.9%)都表现出较好的效果,与阳性对照农用抗病毒药物病毒唑活性相当,在其结构基础上进行一定的结构修饰,有望得到具有更高抗病毒活性的化合物。

湘西州烟草马铃薯Y病毒病的调查分析

为了解湘西土家族苗族自治州烟区烟草马铃薯Y病毒病发生规律,对湘西州7个植烟县烟草马铃薯Y病毒病发生情况开展调查,揭示了湘西州马铃薯Y病毒病的发病规律及特点,并从强化队伍建设、科学栽培管理2个方面提出了有效防治烟草马铃薯Y病毒病的措施,以期为减少烟草生产损失提供参考。

不同药剂对鄂西北烟草马铃薯Y病毒病的防治效果

为探究鄂西北烟区有效的烟草马铃薯Y病毒病防治药剂,降低烟叶种植病害损失,采用随机区组试验设计方法,以鄂西北烟区竹山县、竹溪县2处试验地为例,开展20%琥铜·吗啉胍可湿性粉剂、8%宁南霉素水剂、20%吗胍·乙酸铜可湿性粉剂3种药剂对烟草马铃薯Y病毒病的防效试验。结果表明,3种供试药剂对烟草马铃薯Y病毒病均具有一定的防控作用,但在病前预防和病后防治效果上有一定差异。从预防效果看,20%吗胍·乙酸铜预防效果最好,3次施药,预防效果可达57.45%;其次是20%琥铜吗啉胍,3次预防效果为53.19%,预防在揭膜培土后施药为宜。从防治效果看,20%琥铜·吗啉胍防治效果最好,病后防治3次防治效果高达73.35%,明显高于其他2种药剂;其次是8%宁南霉素,3次防治后效果为53.18%。在生产实践中,可采用20%吗胍·乙酸铜和20%琥铜·吗啉胍结合用药,其中20%吗胍·乙酸铜用于发病前的预防,20%琥铜·吗啉胍用于发病后的防治;8%宁南霉素3个处理防治效果均在50%以上,也可以考虑作为防治鄂西北烟草马铃薯Y病毒病毒病药剂。

马铃薯野生近缘种抗PVY种质资源分子标记辅助筛选

为拓宽四倍体(2n=4x=48)马铃薯栽培种抗马铃薯Y病毒(PVY)的遗传背景,对56份马铃薯野生近缘种进行了PVY抗性分子标记(RYSC3、YES3-3A和Ry364)辅助筛选。PCR检测结果显示,含有Ry_(adg)抗性基因(源自Solanum tuberosum ssp.andigena)分子标记RYSC3的材料有13份,其中二倍体(2n=2x=24)3份,四倍体6份,六倍体(2n=6x=72)4份;含有Ry_(sto)抗性基因(源自S.stoloniferum Schlechtdal)分子标记YES3-3A的材料有4份,其中二倍体1份,四倍体2份,染色体倍性未确定材料1份;含有Ry_(chc)抗性基因(源自S.chacoense Bitter)分子标记Ry364的材料有23份,其中二倍体6份,四倍体4份,六倍体13份。含有RYSC3、YES3-3A和Ry364中任意2种标记的材料有7份,同时含有3种标记的材料仅有OCH 14180a(S.stoloniferum Schlechtdal)。这些种质资源可用于马铃薯抗病毒品种选育、种质创新与基因挖掘。

马铃薯应对马铃薯Y病毒与非介体昆虫胁迫的植物激素水平和基因表达变化

马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)及其非介体昆虫马铃薯块茎蛾(Phthorimaea operculella)是世界马铃薯产业的重要病虫害,为探究PVY是否影响马铃薯对马铃薯块茎蛾的生理响应,本研究分析了马铃薯块茎蛾在PVY侵染和健康对照植株上的生长表现,并对无病虫害、PVY侵染、模拟虫害处理(用马铃薯块茎蛾口腔分泌物涂抹),以及PVY侵染和模拟虫害协同处理的植株叶片进行了植物激素测定和比较转录组分析。结果显示:马铃薯感染PVY后对马铃薯块茎蛾的抗性显著提高;PVY侵染可抑制模拟虫害造成的脱落酸含量上升;与健康对照组相比,模拟虫害和PVY侵染处理分别诱导产生3998个和104个差异表达基因,而两者协同处理可诱导产生9178个差异表达基因,说明这2种胁迫共存对马铃薯产生了极大的生理影响。与模拟虫害处理相比,PVY侵染和模拟虫害协同处理诱导产生743个差异表达基因,而这些基因主要富集在转移酶活性、内质网中蛋白质加工、苯丙素生物合成等通路中,而脱落酸合成通路中众多基因表达下调,与该植物激素变化情况一致。综上所述,本研究系统分析了马铃薯应对PVY侵染、马铃薯块茎蛾模拟虫害以及两者协同处理的生理反应,为探究“植物-病毒-非介体昆虫”三者互作提供了科学依据。

青岛烟区马铃薯Y病毒株系鉴定及系统传导特性

为明确引起青岛试验田烟草脉坏死及花叶的PVY的发生规律、分子进化和系统传导特性,通过病毒病害表型,发病率和病情指数明确青岛试验田病毒病害流行规律;利用MEGA7构建系统发育树鉴定PVY青岛分离物的株系;通过q RT-PCR,western blotting和PVY-GFP荧光明确PVY侵染烟株的传导路径;通过不同叶位、不同症状病叶取样,利用q RT-PCR检测PVYCPm RNA相对含量,明确显症和隐症叶片的病毒含量差异,以及TMV、CMV、PVY单独、两者混合、三者混合侵染时的干扰或协生作用。结果显示:烟株成熟期,PVY与TMV和CMV混合发生严重,PVY分离物为N:O株系,未突破va基因抗性。在侵染早期,病毒从接种叶沿叶脉进入茎,开始双向运输时,先向根部移动,进而到达苗端;再扩散至上部叶,较慢移动至下部叶;最后伴随烟株生长持续向两端新生部位运输。侵染中期病株上部叶隐症现象显著,病叶症状与病毒浓度呈正相关。烟田中后期,PVY与TMV和CMV混合侵染,病毒间的干扰和协生作用导致症状复杂多变。研究结果有助于提高品种抗性鉴定试验的准确性和药效试验的靶标性。

不同品种(系)马铃薯休眠块茎顶端和茎端芽眼组织马铃薯Y病毒含量分析

马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯生产中较常见的病毒之一,马铃薯病毒的检测是生产中保障马铃薯品质和产量的重要基础,收获后批量检测是进行种薯质量评价的主要依据之一。研究针对‘56-2’‘Ivory Russet’‘Clearwater Russet’‘龙薯14号’‘龙薯3号’‘龙薯15号’‘龙育201401-70’‘龙薯7号’‘克新23号’和‘克新28号’马铃薯品种(系)休眠块茎样品,采用TRIzol法提取马铃薯休眠块茎顶端和茎端芽眼组织的总RNA,经qRT-PCR和RT-PCR检测分析,比较块茎的顶端与茎端芽眼组织PVY含量分布的情况。结果表明,上述供试材料的休眠块茎茎端芽眼组织PVY浓度均高于顶端芽眼组织,能够精准的检测到病毒的存在;对‘Ivory Russet’品种的休眠块茎选取100个带病样品通过TRIzol法提取顶端与茎端的总RNA,采用4合1的方法合样后进行PVY RT-PCR检测,所有处理的顶端芽眼组织检测条带亮度低于茎端芽眼组织。可见,马铃薯休眠块茎茎端芽眼组织取样能够更加精准的检测出PVY。研究结果为马铃薯种薯收获后PVY的检测及合理取样提供了科学依据。

β-罗勒烯对烟草马铃薯Y病毒防控效果的研究

β-罗勒烯是一种能诱导植物产生防御反应的植物通讯信号分子。本文为了探究β-罗勒烯对烤烟马铃薯Y病毒病(PVY)的控制效果,在室内条件下,分析了β-罗勒烯对PVY的发病率及病情指数的影响;在大田条件下,同时分析了β-罗勒烯与常规化学农药对PVY的防控效果。试验结果如下:通过室内盆栽试验分析,β-罗勒烯对PVY具有显著的防控效果,相比于对照发病率下降了67.10%,病情指数下降了70.60%,病毒积累量减少了1.7倍。大田试验结果显示,β-罗勒烯对PVY的控制效果显著优于化学农药,对PVY的控制效果达到58.23%~64.12%;进一步对PVY病情上升率进行统计,结果表明,经β-罗勒烯诱导后PVY的病情指数仅上升了10.0%,显著高于化学农药及对照。以上结果均表明,β-罗勒烯在防控PVY方面具有显著功效。本研究为大田防控PVY提供了新的途径。

青岛及周边地区马铃薯Y病毒株系类型分析

马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)是目前马铃薯生产中的重要病毒,PVY侵染马铃薯会造成产量、质量的严重下降。为了探明青岛及周边地区PVY株系类型,本次共采集青岛及周边地区485份马铃薯疑似PVY样本,共检测出298份PVY阳性样本。对PVY样本进行RT-PCR扩增,结果显示:本地区的主要株系为PVY^(NTN-NW)(SYR-Ⅱ型),占比为62.4%;PVY^(N-Wi)株系占比为31.6%;复合侵染株系占比为6.0%。对复合侵染株系的单株块茎(编号ShouGuang)进行测序、BLSAT比对及Simplot和RDP软件分析,显示PVY复合侵染的马铃薯植株体内存在两种重组类型(ShouGuang-Y1和ShouGuang-Y2);发生重组的位点主要集中在P1-1、HC-Pro/P3、6K2/VPg 3个区域。通过对PVY的不同变异株系分析,可为PVY株系的遗传多样性提供理论基础,为青岛及周边地区PVY防控提供理论依据。

中国马铃薯Y病毒的检测鉴定及CP基因的分子变异

【目的】查明马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)病在中国的发生情况,及时、准确地鉴定出PVY并对其分子变异进行分析。【方法】采用ELISA方法对采自中国14个省(直辖市)马铃薯种植区疑似受PVY感染的样品进行了检测,并对其中的部分材料镜检验证,然后根据CP基因序列设计1对简并引物针对随机选择感染PVY的14个省(直辖市)代表样品进行CP基因扩增克隆,将测序得到的序列进行分子变异分析,并使用贝叶斯法(Bayesian inference,BI)重建系统发育关系。【结果】ELISA检测结果表明,691份样品中220个样品与PVY抗体呈阳性反应,其余呈阴性反应;ELISA检测的阳性材料在透射电镜下均可观察到明显的风轮状内含体,14个PVY分离物均成功扩增出预期大小(约800 bp)的特异性片段,CP基因的核苷酸序列与已报道PVY不同株系的核苷酸序列一致性均在88%以上;在14个PVY分离物CP基因中共发现有29个多态性位点,其中6个简约信息位点,23个单一变异位点。系统发育分析结果显示,14个PVY分离物与PVYN:O株系相聚成簇,表明其在系统发育关系上,与PVYN:O株系的亲缘关系最近。【结论】PVY CP基因高度保守,但不同地区分离物也存在一定的分子变异,本研究可为今后了解PVY病毒病流行、变异趋势及其防治提供依据。

翻译和非翻译马铃薯Y病毒外壳蛋白基因介导的抗病性比较

利用RT PCR方法克隆获得马铃薯Y病毒烟草叶脉坏死株系 (PVYN)的可翻译和不可翻译外壳蛋白 (CP)基因 ,并分别插入 pROKⅡ质粒中获得重组双元表达载体。通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens) 介导的基因转化方法 ,将可翻译和不可翻译的PVYN CP基因分别导入烟草栽培品种NC89叶片组织中 ,得到抗卡那霉素的再生植株。对所得到的抗卡那霉素的再生苗进行PCR检测表明 ,被导入可翻译和不可翻译CP基因的植株分别占卡那霉素抗性植株的 95 %和 98%。攻毒实验表明 ,两种类型的转基因烟草对PVYN 的抗病性具有相似性 ,其表现型为 :免疫、抗病和感病。免疫型转基因植株的抗病性不受接种物类型及其剂量的影响。Southern印迹杂交结果显示 ,目的基因已经整合到烟草基因组中。Northern印迹杂交证明 ,两种类型的CP基因都已在RNA水平上得到了表达 ,但细胞内RNA的积累量与转基因植株的抗病强度成负相关。Western印迹杂交表明 ,在表达不可翻译PVYN CP基因的转基因植株内未检测到CP蛋白 ,而在导入可翻译的PVYN CP基因的植株内检测到了CP蛋白 ,且CP蛋白含量与抗病性不存在正相关。本研究结果证明 ,表达可翻译与不可翻译PVYN CP基因的转基因烟草对PVYN 的抗病性均为RNA介导的抗病性。

利用RNA介导的抗病性获得高度抗马铃薯Y病毒的转基因烟草

以马铃薯 Y病毒坏死株系 (PVYN)的 RNA为模板 ,应用反转录 -聚合酶链式反应 (RT- PCR)方法 ,扩增出长度为 80 1bp的非翻译的马铃薯 Y病毒外壳蛋白基因。将扩增的片段克隆到 p BSK的Bam HI和 Kpn I之间并进行了序列测定。用 Bam HI和 Kpn I从重组克隆载体上切下该基因并插入到质粒 p ROKII内得到植物表达载体 p PVYCP。通过根癌农杆菌 (LBA4 40 4 )介导的方法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选、PCR和 Southern blot检测 ,获得 82株转基因植株。 Northern blot和Western blot分析表明 ,转基因植株只在 RNA水平上得到了表达。抗病性试验表明转基因植株之间抗性水平存在着差异 ,其中有 7株是对 PVYN高度抗病性的植株。转基因植株抗病特异性试验初步表明 ,对 PVYN 表现高度抗病的植株对 PVYO 也具有高度抗病性。

PVY和PVS病毒复合侵染对马铃薯光合及营养品质的影响

以2个马铃薯高代品系为实验材料,研究马铃薯病毒Y(PVY)和S(PVS)复合侵染对马铃薯叶片SPAD值、最大净光合速率、表观量子效率、气孔导度、暗呼吸速率、蒸腾速率、光补偿点、胞间CO_2浓度和饱和光强等光合参数,以及马铃薯块茎产量、干物含量、淀粉含量、还原糖含量、粗蛋白含量等产量品质指标的影响。结果表明:(1)田间受到PVY和PVS病毒复合侵染后,马铃薯品系2010-11植株的叶片PVS病毒含量显著低于品系34-2植株,2010-11植株的叶片PVY病毒含量同样低于品系34-2植株,但差异不显著。(2)与对照相比,感病后马铃薯品系34-2和2010-11的平均单株产量分别显著降低48.54%和19.98%,淀粉含量分别降低8.06%和3.38%,但不显著;粗蛋白含量分别显著升高14.05%和29.17%;还原糖含量分别显著降低11.11%和14.29%;34-2干物量含量显著降低6.9%,2010-11干物质含量略降低0.66%。(3)两品系感病植株的光合参数SPAD值分别显著降低13.37%、20.10%;最大净光合速率分别显著降低32.48%和4.54%;其它光合参数变化没有规律性。研究发现,PVY和PVS病毒混合侵染使马铃薯植株叶片叶绿素含量显著降低,进而影响光合作用的正常进行;病毒侵染使块茎中还原糖和淀粉的积累显著受到抑制,但能够促进块茎中粗蛋白的含量显著提高。

正向和反向重复RNA介导的抗马铃薯Y病毒基因工程比较研究

RNA介导的病毒抗性与RNA沉默现象密切相关。反向重复cDNA序列(IR)的转录产物往往形成双链RNA结构,而双链RNA是诱发RNA沉默的有效因子。据此,本研究通过体外合成马铃薯Y病毒坏死株系衣壳蛋白基因(PVYN-CP)5'端反向重复cDNA序列和正向重复cDNA序列(DR),分别构建植物表达载体pROK-IR和pROK-DR,利用农杆菌介导方法转化烟草NC89,比较这2种转基因烟草在RNA介导抗病性方面的差异。抗病性检测表明,转化IR和DR的转基因烟草均可获得抗病程度达到免疫的植株,但转化IR序列可大大提高抗病植株在转基因植株中的比例。分析结果表明所获得的抗病性为RNA介导的抗病性,是RNA沉默的结果。这一研究结果为利用IR策略进行抗病毒遗传育种提供了理论依据,并为讲一步开展RNA介导抗病性的机制研究奠宗了基础。

CP基因3'端短片段介导的对马铃薯Y病毒的抗性

目的探明马铃薯Y病毒脉坏死株系(PVYN)CP基因3′端序列短片段的不同结构转基因诱导转基因植物产生RNA介导抗性的有效性。方法以PVYN的CP基因cDNA3′端202bp片段构建非翻译的正向重复和反向重复结构的植物表达载体转化烟草。结果攻毒试验表明前者没有一例转基因植株表现为抗病,而转化反向重复结构的转基因植株82.8%表现近似免疫的高度抗病型,Southern印迹杂交证明目的基因已整合到烟草基因组,Northern印迹杂交结果显示反向重复结构转基因植物的抗病性与RNA的表达量呈现负相关。结论抗病性是RNA介导的病毒抗性。3′端短片段诱导产生的转基因抗病株比例比5′端短片段诱导产生的高。

马铃薯Y病毒两分离物特性及其侵染寄主的超微结构比较研究

报道了马铃薯 Y病毒两分离物的生物学和血清学特性、病毒粒体形态大小以及它们引起的寄主细胞病变特征等方面的差异。从山东省主要烟草和马铃薯种植区病毒样品中分离到两个马铃薯 Y病毒分离物 ,分别为 PVY- T和 PVY- P。两分离物在寄主植物上的症状表现、体外抗性、蚜传特性、血清学以及病毒粒体大小等方面存在着明显的差异。同时 ,这些结果与作对照的 PVY标准株系 PVYN和PVYO相比较 ,初步推测分离物 PVY- T属于 PVYO 株系 ,而 PVY- P则属于 PVYN。通过对受侵染寄主的细胞超微结构观察比较发现 ,这两种 PVY分离物在寄主细胞内的分布特征、内含体以及与寄主互作后所引起的细胞病变也明显不同 ,这些可能成为区别 PVY不同株系的依据之一。

用生物素标记外壳蛋白基因cDNA探针检测葡萄扇叶及马铃薯Y病毒

以葡萄扇叶病毒(GFV)干u马铃薯Y病毒(PVY)外壳蛋白基因的重组质粒为模板,用聚合酶链式反膨技术(PCR)分别合成了长度为1.5kb和0.75kb的生物素标记双链cDNA探针,在斑点杂交反应中,探针的最适使用浓度为1/100,GFV探针检测GFV-RNA的灵敏度为10pg,检测提纯GFV的灵敏度为25pg,检测感病苋色藜的最大稀释倍数为10000倍;PVY探针检测PVY-RNA的灵敏度为30pg,检测提纯PVY灵敏度为500pg,感病烟草检测的最大稀释度为8000倍,阴性对照均无杂交信号出现。

马铃薯Y病毒单克隆抗体的制备及其检测应用

马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是危害农作物的重要病毒之一,在全球广泛传播并造成了严重的经济损失,而建立特异、灵敏的检测技术是防控PVY的关键。本研究以提纯PVYN病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得4株能分泌PVY单克隆抗体的杂交瘤细胞株(3B2、3E4、20B2和25C2),杂交瘤细胞分泌的腹水单抗的效价在10^(-6)~10^(-7)之间,Western blot分析发现3B2、3E4和20B2这3株单抗仅与感染PVY的叶片中1条分子质量约为30ku的蛋白有特异性反应。该蛋白的分子质量与PVY的外壳蛋白亚基大小相符,推测制备的这3个单抗能识别PVY的外壳蛋白亚基,而25C2单抗与感染PVY的病叶组织中约55ku的蛋白有特异性反应。进而以制备的单抗为核心建立了检测植株中PVY的ACP-ELISA、dot-ELISA、tissue blot-ELISA和IC-RTPCR这4种血清学方法。特异性分析结果表明,这4种血清学方法检测感染PVY的样品呈阳性反应,而检测健康的烟草和马铃薯及感染马铃薯S病毒、马铃薯X病毒、马铃薯卷叶病毒、马铃薯A病毒的样品呈阴性反应;灵敏度分析结果表明,ACP-ELISA和dot-ELISA检测马铃薯病叶的灵敏度分别达1∶81 920倍和1∶10 240倍稀释(g/mL),而具有最高检测灵敏度的IC-RT-PCR方法在感病植物组织稀释到1∶5 242 880倍(g/mL)时仍能检测到病毒。用建立的血清学方法对2015年采自云南的30个田间马铃薯样品进行检测,结果发现其中有20样品感染PVY,且血清学方法的检测结果与RT-PCR结果一致。抗PVY特异、灵敏单抗的制备及血清学检测方法的建立,为我国作物上PVY的检测和诊断、脱毒种薯生产、抗病育种和科学防控提供了物质和技术支撑。