属级芯片筛查技术在马铃薯纺锤块茎类病毒属检测中的应用

建立马铃薯纺锤块茎类病毒属(Pospiviroid)类病毒有效的芯片筛查技术,对该属类病毒进行筛查。分析了该属类病毒序列,得到19条具有属级鉴定特征的探针。这些探针符合GC含量在40%与60%之间、单个核苷酸含量不大于50%、无多于4个核苷酸的连续重复及不形成多于6个核苷酸的发卡结构的标准;将探针点制到玻璃片基上制备芯片。芯片探针有效性实验结果表明,菊花矮化类病毒(Chrysanthemum stunt viroid,CSVd)及番茄雄性株类病毒(Tomato planta macho viroid,TPMVd)样品杂交可获得有效信号;灵敏度实验结果表明,该芯片可检测到200 pg/μL的总RNA。该芯片可用于Pospiviroid类病毒的筛查。

马铃薯纺锤块茎类病毒RT-PCR检测及全序列分析

根据马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)基因序列设计合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板,经RT PCR法扩增出全长的cDNA片段,结果从感病组织中扩增出与预期的360bp大小的目标片段,而健康组织无此扩增产物;将其克隆到质粒pGEM T载体上,进行全序列分析。结果表明,与国内外的报道相比较,核苷酸同源率高达98%以上。PCR产物克隆作为RT PCR反应的阳性对照,解决了毒源保存和传播的问题,为进一步进行抗PSTVd基因工程研究打下了良好基础。

特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶的构建和体外活性测定

根据锤头型核酶的作用模式 ,设计、合成并克隆了特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒 (PSTVd)负链RNA不同区域位点的双价和三价锤头型核酶基因。通过体外转录 ,将PSTVd负链RNA分别与双价和三价核酶混合 ,37℃温育 2h。结果表明 ,双价核酶和三价核酶均表现出较高的切割活性 ,其中双价核酶处理的切割产物的大小与理论值相符合。三价核酶虽表现出较高的切割活性 ,但只是其中一价核酶在起作用。讨论了二价和三价核酶的应用前景。

乌鲁木齐地区马铃薯纺锤块茎类病毒的检测与序列分析

根据马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）基因序列设计合成1对引物,对新疆乌鲁木齐地区马铃薯田间感病植株进行一步法RT-PCR检测,扩增出251 bp大小的目标片段,而健康植株无此扩增产物。将目的片段克隆到pGM-T载体上并进行序列测定,构建系统进化树分析各分离物间的分子差异性。结果表明马铃薯纺锤块茎类病毒乌鲁木齐分离物与国内外已报道毒株的核酸序列同源性达93.6%~99.2%。

马铃薯纺锤块茎类病毒山西分离物侵染性克隆的构建

马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viriod,PSTVd)侵染马铃薯会严重影响薯块的产量和品质。根据PSTVd的同源序列设计引物,以山西省马铃薯感病块茎中提取的总RNA为模板,经RT-PCR方法扩增出全长cDNA片段,将其克隆到质粒pBS-T载体上,进行序列分析。结果表明,该类病毒全长359 nt,能通过分子内序列互补形成致密的二级结构。以该序列作为种子序列进行Blast搜索,该序列与PSTVd荷兰分离物(GenBank登陆号:AY372400.1)的序列一致性为100%。将该序列与东北株系、河北株系及已公布的弱株系(GenBank登陆号:M14814.1)、强株系(GenBank登陆号:U23058.1)、中间株系(GenBank登陆号:AY937179.1)比对,有12个核苷酸具有多态性,其中有5个发生在致病区。将线性化的质粒pBS-PSTVd及其PSTVd的体外转录产物接种番茄矮红宝的无毒苗,20 d后接种株轻微显症,RT-PCR检测均呈阳性。将RT-PCR产物测序,其结果与接种的PSTVd原序列完全一致,证实构建的PSTVd山西分离物的克隆具有侵染性。

部分发展中国家马铃薯纺锤块茎类病毒病情况调查

马铃薯类病毒病是威胁世界马铃薯生产的主要病害之一,更影响着发展中国家马铃薯产业的发展。2008~2010年,黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所连续3年举办了马铃薯病害检测技术国际培训班,对部分发展中国家从事马铃薯工作的人员进行培训,在培训过程中进行了马铃薯类病毒方面的问卷调查,调查结果显示：这些发展中国家对马铃薯纺锤块茎类病毒比较了解,发病较重的国家不多,但总体检测水平不高,甚至不进行马铃薯类病毒的检测,多数国家不重视马铃薯纺锤块茎类病毒病的防治工作。因此,马铃薯纺锤块茎类病毒病是发展中国家的隐患。

中国流行的马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）株系鉴定及其对产量的影响

从河北、内蒙古、山西、黑龙江、福建等省区采集虎头、克疫、紫花白、同薯８号、克新１号、克新４号和克新６号、燕子以及米拉等不同栽培品种感染ＰＳＴＶｄ的马铃薯样品中，制备ＰＳＴＶｄ粗提取物，以加拿大ＰＳＴＶｄ强毒株系（Ｓ－ＰＳＴＶｄ）和弱毒株系（Ｍ－ＰＳＴＶｄ）作对照，采用往返式聚丙烯酰胺凝胶电泳（Ｒ－ＰＡＧＥ）进行株系鉴定．结果表明，感染中国不同马铃薯品种ＰＳＴＶｄ的电泳迁移率均与加拿大Ｍ－ＰＳＴＶｄ的迁移率相同．初步表明侵染中国马铃薯的ＰＳＴＶｄ主要是Ｍ－ＰＳＴＶｄ．用ＰＳＴＶｄ虎头分离物，采用针刺块茎幼芽和叶片摩擦接种方法，分别接种到无ＰＳＴＶｄ的健康虎头和克皮上．检测结果表明，在初感染和续发感染植株中，ＰＳＴＶｄ浓度分布有共同的规律，从顶部叶片、中部叶片到基部叶片中ＰＳＴＶｄ浓度依次逐渐减少．ＰＳＴＶｄ接种明显抑制了植株生长，并造成较大的产量损失．由不同品种初感植株收获的块茎，均有很高的ＰＳＴＶｄ感染率．

马铃薯纺锤块茎类病毒检测技术比较与选择

马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)是威胁我国马铃薯生产的重要病害之一,目前有多种技术可应用于PSTVd的检测,如生物学方法、电子显微镜技术、往返聚丙烯酰胺凝胶电泳(R-PAGE)、核酸斑点杂交(NASH)、RT-PCR和FQ RT-PCR。这些方法各有利弊,互相补充,构成了PSTVd的检测技术体系。日常工作中,应根据自身条件及目的等科学地选择适宜的检测技术,确保脱毒种薯/种苗的质量。

福建省马铃薯纺锤块茎类病毒快速检测及序列分析

为检测福建省马铃薯纺锤块茎类病毒及了解其分子变异情况,以感染马铃薯纺锤块茎类病毒的植株为试验材料,提取RNA,反转录cDNA,利用设计合成的特异性引物进行RT-PCR检测,扩增产物经回收纯化后克隆和测序。结果表明,PCR扩增出359bp的特异片段,将扩增产物经回收和纯化并进行克隆与测序,测序结果经BLAST比对后,该片段为PSTVd基因序列,PSTVd分离物命名为Fujian PTSTd(KM588065.1),与国内外报道的PSTVd分离物同源性达98%以上。该分离物与弱毒株系(M14814.1)、中间株系(AY492084.1)和强毒株系(U23058.1)比对,有11个核苷酸具有多态性,其中5个发生在致病区。不同国家和地区序列进化树分析表明,该分离物与我国北方及欧美国家分离物亲缘关系最近,与新西兰分离物亲缘关系最远。

延安地区马铃薯纺锤块茎类病毒的RT-PCR检测与序列分析

以陕西省延安地区8个乡镇种植2～3代的马铃薯叶片为材料,Trizol法提取马铃薯叶片总RNA,以已公布的马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）基因序列设计合成特异引物,反转录合成cDNA,RT-PCR扩增目的基因片段并电泳检测,回收纯化目的片段,然后进行克隆和测序,采用DNAstar软件分析序列一致性.结果显示：在马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致的目的片段,表明这些乡镇的马铃薯均感染了PSTVd,8个采样点PSTVd的目的片段大小为247～251bp,出现少量碱基的突变或缺失,说明PSTVd在延安地区部分乡镇发生了一定程度的变异,与国内外其他14个地区之间的序列一致性为804% ～992%.

榆林地区马铃薯纺锤块茎类病毒的RT-PCR检测与序列分析

以陕西省榆林地区种植2～3代的马铃薯叶片为材料,首先用Trizol法提取马铃薯叶片总RNA,以已公布的马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）基因序列设计合成一对特异引物,反转录合成cDNA,通过RT-PCR扩增目的DNA片段,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物;然后回收纯化扩增产物并进行克隆和测序,采用DNAstar软件分析序列一致性。电泳结果表明,在榆林地区的马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致的目的片段,说明这些马铃薯均感染了PSTVd;序列分析表明,10个不同采样点PSTVd的目的片段大小为250～251 bp,只是单个碱基之间的转换或缺失,PSTVd在榆林地区几乎没有发生变异,与国内外其他15个地区已报道的序列一致性在82.3%～99.5%之间。

单酶法RTP-CR检测马铃薯纺锤块茎类病毒

根据Taq酶既有聚合酶活性又有反转录酶活性的特点 ,探索了只在Taq酶单独作用下完成RT PCR反应的条件 ,以达到对马铃薯纺锤块茎类病毒 (PSTV)的快速检测。结果表明 ,反转录阶段退火温度在 37℃、循环数不少于 10次的情况下 ,PCR扩增能得到一条相关特异带。经过嵌合式PCR证明 ,这条带为PSTV的特异带。与其他检测方法相比 ,用单酶法RT PCR检测PSTV步骤简单 。

马铃薯生产中马铃薯纺锤块茎类病毒的综合防治

马铃薯纺锤块茎类病毒是影响中国马铃薯生产重要的检疫性病害。该病害具有广泛的自然寄主,可侵染马铃薯、番茄和辣椒等重要作物。该病害可通过植物学种子、花粉或卵细胞、无性繁殖以及机械等方式传播。马铃薯纺锤块茎类病毒可造成马铃薯产量降低,块茎畸形、变小,商品性和商品薯率下降。该病害主要可通过培育抗病品种、使用脱毒种薯、加强种质资源和种薯卫生管理、加强检验检疫以及实行马铃薯种薯质量认证制度等措施进行综合防治。

马铃薯纺锤块茎类病毒对马铃薯育种工作的影响

简要介绍了马铃薯纺锤块茎类病毒（Potato spindle tuber viroid,PSTVd）的危害和发生情况,重点阐述了PSTVd对马铃薯育种工作的影响,并针对该问题进行了分析,最后提出了一些建议,如做好隔离防护,彻底进行PSTVd检验,对环境及器具进行消毒处理以及实生种子经贮藏3~5年后再播种。

马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)的检测与防治研究进展

详细阐述了马铃薯类病毒(PSTVd)鉴定技术的研究进展,比较了几种鉴定技术(指示植物、往返电泳、核酸斑点杂交及RT-PCR)的优缺点,并对类病毒的防治措施进行了论述。

马铃薯纺锤块茎类病毒不同株系及不同接种方法对产量的影响

马铃薯纺锤块径类病毒(Potato spindle tuber viroid)是危害黑龙江省马铃薯生产的一种重要病害。为了查明不同类病毒变株对主栽品种克新1号和4号所引起的产量损失和症状反应,应用往复聚丙烯胺凝胶电泳法(Peturn-Polyacmdegel electophoresis)鉴定类病毒。试验结果表明,接种当年,接种类病毒的处理平均减产37%,按商品产量计算减产达47%。当年表现症状的植株平均为59.6%,块茎产生症状的植株平均为57.4%。用于接种的3个马铃薯纺锤块茎类病毒变株的致病力,以当地的类病毒弱系为最强,其次为北美的类病毒强系,北美的类病毒弱系的致病力较弱。类病毒对产量的影响与马铃薯品种和类病毒变株的组合有极为密切的关系。克新1号接种当地的类病毒弱系时薯块严重畸变,商品产量只为不接种对照的21%。用往复电泳法检测各个试验处理被类病毒侵柴的情况,芽接种处理,于出苗后1周即可检测到类病毒,叶接种处理,于接种后2周即能检测到类病毒。出苗后7周,植株中类病毒浓度达到高峰,随即急剧下降,到出苗后10周,大部分接种植株已检测不到类病毒。块茎直径达1厘米时,即能检测到类病毒,随着块茎膨大,类病毒浓度也相应增高,到收获前,块茎中的类病毒含量只略低于植株含类病毒高峰期的浓度。用于本试验的克新1号、4号无类病毒和主要马铃薯病毒的核心材料,在1988年已交付给省内外的良种场繁殖使用。于当年秋季抽样检测克山第二良种场连续种植二年的种薯,当年种植试管苗生产的种薯,以及试管苗等,均未检测到类病毒。

黄瓜花叶病毒卫星RNA与马铃薯纺锤形块茎类病毒间序列同源性与碱基配对

黄瓜花叶病毒卫星ＲＮＡ与马铃薯纺锤形块茎类病毒间序列同源性与碱基配对田波（中国科学院微生物研究所，北京１０００８０）Ｇ．ＳｔｅｇｅｒＤ．Ｒｉｅｓｎｅｒ（ＩｎｓｔｉｔｕｔｆｕｒＰｈｙｓｉｋａｌｉｓｃｈｅＢｉｏｌｏｇｉｅ，ＵｎｉｖｒｓｉｔａｔＤｕｓｓｅｌ...

马铃薯纺锤块茎类病毒对产量影响研究

利用在试管中保存的马铃薯纺锤块茎类病毒（pstvd）的纯毒源，在防虫的网棚（网绷纱要求100目）中，利用金钢砂、喷粉器、棉球、研钵，将毒源中加入0．1ml磷酸缓冲液后将其研碎，接种在克新2号、克新3号、克新4号的植株上。该试验进行两次接种，第1次接种10d后，进行第2次接种．根据植株的外观表现：健康株、健康株生长势低于前者、轻束顶症株、重束硕症株来判定接种纺锤块茎症病毒后植株的发病情况，根据小区测产对比总结出马铃薯纺锤块茎类病毒对马铃薯产量影响的程度．克新2号品种减产27．2%-61．80％；克新4号品种减产17．40％-57．40％。

以马铃薯ND2 mRNA为内对照双重RT-PCR法检测马铃薯纺锤块茎类病毒

根据马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)基因序列设计特异引物,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术进行PSTVd检测研究。为避免由于提取的RNA降解或者RT-PCR反应质量不高所造成的假阴性问题,在检测过程中引入马铃薯线粒体NADH脱氢酶ND2亚基基因mRNA为内对照,该内对照的一个引物跨越了该基因内含子区域,只对剪接后的mRNA进行特异扩增而不扩增其本身DNA。利用内对照引物和PSTVd特异引物进行双重RT-PCR检测,分别扩增出190 bp的内对照基因特异片段和360 bp的PSTVd特异条带,与预期引物设计大小一致。引入的内对照可以较好地监控PSTVd的RT-PCR检测过程。

吉林地区马铃薯纺锤块茎类病毒检测研究

马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)是世界范围内影响马铃薯生产的主要病害之一。通过RT-PCR技术,针对吉林地区马铃薯主栽品种"春薯4号"等11个品种,18份材料,检测马铃薯纺锤块茎类病毒,为RT-PCR检测方法在本区域的广泛应用提供技术指导。结果表明,18份试验材料中Y217-2和09-Y217-1带有马铃薯纺锤块茎类病毒,其余品种不含有马铃薯纺锤块茎类病毒,且扩增出来的片段长度与预期目的片段大小相同,证明植株感染病毒与培养时期和培养条件不存在相关性。