马铃薯A病毒(PVA)运动相关蛋白质的研究进展

综述了马铃薯A病毒(PVA)运动相关蛋白的结构、功能方面的研究进展。

河北保定地区黄瓜花叶病毒与马铃薯Y病毒复合侵染叶用莴苣分子鉴定

利用RT-PCR方法对采集自河北保定地区的疑似叶用莴苣病毒病样品进行分子生物学鉴定,并构建系统发育进化树。结果表明,特异性引物CMV和PVY分别扩增得到大小为260、420 bp的单一条带;通过核苷酸序列Blast比对及系统进化树分析,河北保定地区叶用莴苣病毒分离物分别与印度番茄CMV分离物(MN514839.1)、印度马铃薯PVY分离物(JX945850.1)聚在同一分支上,同源性分别为95%、92%。本研究首次检测到河北保定地区叶用莴苣病毒病是由CMV与PVY复合侵染所致。

马铃薯转录组数据中的病毒序列挖掘

转录组测序数据中包含寄主所感染的病毒序列信息。为分析和验证马铃薯转录组数据中存在的病毒序列,试验收集了关于马铃薯块茎发育、抗病、抗逆等研究的9个马铃薯转录组测序数据样本,过滤掉来源于马铃薯转录本的读段,组装并与病毒数据库进行本地比对,获得样本中相关病毒序列的种类和数量信息。病毒来源的读段在各样本中普遍存在,占总读段的0.12%~20.24%。这些读段组装得到10种植物病毒,包括9种RNA病毒和1种DNA病毒。其中来源于马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)的序列最多,组装得到28条近全长序列。进一步系统进化分析表明,这些样品中同时存在PVSA和PVSO两种株系类型。此外,通过RT-PCR对转录组数据原始样本中的马铃薯H病毒(Potato virus H,PVH)、马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)、马铃薯M病毒(Potato virus M,PVM)、PVS、马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)和马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)6种病毒进行检测,结果显示RT-PCR验证结果与测序数据组装结果基本一致。该研究为马铃薯病毒多样性和进化分析提供一种高通量测序的方法。

β-氨基丁酸诱导马铃薯Y病毒抗性及信号转导途径研究

马铃薯Y病毒(PVY)是目前马铃薯、烟草等作物生产过程中危害最严重的病毒病之一,严重影响作物产量和品质。为探究β-氨基丁酸(BABA)对植物PVY抗性的诱导作用,以烟草品种Samsun为试验材料,通过对叶面喷施BABA,探究BABA对烟草PVY抗性的诱导作用及信号转导途径。结果表明,叶面喷施BABA可有效诱导烟草对PVY的抗性,其中5 mmol/L BABA对烟草PVY抗性诱导效果最明显。与对照相比,对感染PVY的植株喷施5 mmol/L BABA可以使叶片明脉推迟3~4 d出现,同时抑制由PVY引起的茎部坏死程度,经qRT-PCR测定发现,在接种病毒第5、7、10、14天的植株中,BABA处理组对PVY表达量的抑制率相较于对照组分别达到98.70%、96.62%、98.40%、66.89%,病理症状观察结果与分子检测结果相符合。通过高效液相色谱外标法对样品提取液进行分析发现,5 mmol/L BABA处理可诱导烟草内源水杨酸(SA)含量的峰值出现时间早于PVY病毒表达量峰值的出现时间,并有效调节烟草植株内活性氧动态平衡。通过qRT-PCR和H_(2)O_(2)原位表征测定得出,BABA处理在激活防御体系时,通过抑制相关抗氧化酶CAT的基因表达量,使H_(2)O_(2)在植株内适量积累,可在诱导抗性的同时降低H_(2)O_(2)对植株的毒害作用。结果表明,BABA对PVY的抗性诱导与SA作为信号分子参与诱导植株防卫基因表达过程存在紧密相关性。

含氟异喹啉二酮衍生物的合成及其抗马铃薯Y病毒活性分析

为了探索更高抗植物病毒活性的新药物分子,采用较廉价的原料、较温和的反应条件合成了12个含氟基团异喹啉二酮衍生物,并采用半叶枯斑法对合成的目标化合物进行抗马铃薯Y病毒(PVY)活性测定。结果表明:含氟异喹啉二酮衍生物对马铃薯Y病毒(PVY)具有较好的抑制活性,其中化合物3e的治疗活性(43.5%)、保护活性(47.1%)、钝化活性(51.9%)都表现出较好的效果,与阳性对照农用抗病毒药物病毒唑活性相当,在其结构基础上进行一定的结构修饰,有望得到具有更高抗病毒活性的化合物。

青海地区马铃薯主要病毒检测与分析

病毒病是影响马铃薯产量和种薯质量的重要因素之一。为了解青海省马铃薯主要病毒种类,本研究于2019—2020年从青海省湟中区、大通回族土族自治县、湟源县、互助土族自治县和乐都区生产田中采集疑似病株叶片245份,从不同级别种薯上采集种薯201份。应用酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)对马铃薯PVY、PVX、PLRV、PVA、PVM、PVS和AMV等7种主要病毒进行筛查。结果表明:在105份样品中检测到病毒,其中PVY病毒的检出率最高,为28.98%;PVS的检出率次之,为21.22%;PLRV、PVX、PVM和PVA的检出率相对较低,分别为5.31%、4.90%、4.49%和2.86%;未检测到AMV。2种病毒复合侵染较普遍,主要类型为PVY+PVS,侵染率达到10.20%;未发现3种及以上病毒复合侵染现象。在不同县区马铃薯生产田中病毒种类和带毒率差异明显。不同级别种薯的病毒检测结果符合马铃薯种薯质量标准。

湘西州烟草马铃薯Y病毒病的调查分析

为了解湘西土家族苗族自治州烟区烟草马铃薯Y病毒病发生规律,对湘西州7个植烟县烟草马铃薯Y病毒病发生情况开展调查,揭示了湘西州马铃薯Y病毒病的发病规律及特点,并从强化队伍建设、科学栽培管理2个方面提出了有效防治烟草马铃薯Y病毒病的措施,以期为减少烟草生产损失提供参考。

不同药剂对鄂西北烟草马铃薯Y病毒病的防治效果

为探究鄂西北烟区有效的烟草马铃薯Y病毒病防治药剂,降低烟叶种植病害损失,采用随机区组试验设计方法,以鄂西北烟区竹山县、竹溪县2处试验地为例,开展20%琥铜·吗啉胍可湿性粉剂、8%宁南霉素水剂、20%吗胍·乙酸铜可湿性粉剂3种药剂对烟草马铃薯Y病毒病的防效试验。结果表明,3种供试药剂对烟草马铃薯Y病毒病均具有一定的防控作用,但在病前预防和病后防治效果上有一定差异。从预防效果看,20%吗胍·乙酸铜预防效果最好,3次施药,预防效果可达57.45%;其次是20%琥铜吗啉胍,3次预防效果为53.19%,预防在揭膜培土后施药为宜。从防治效果看,20%琥铜·吗啉胍防治效果最好,病后防治3次防治效果高达73.35%,明显高于其他2种药剂;其次是8%宁南霉素,3次防治后效果为53.18%。在生产实践中,可采用20%吗胍·乙酸铜和20%琥铜·吗啉胍结合用药,其中20%吗胍·乙酸铜用于发病前的预防,20%琥铜·吗啉胍用于发病后的防治;8%宁南霉素3个处理防治效果均在50%以上,也可以考虑作为防治鄂西北烟草马铃薯Y病毒病毒病药剂。

马铃薯病毒PVA试管苗保存效果的研究

通过对含马铃薯病毒PVA的毒源马铃薯和毒源烟草茎尖在试管中培养 ,保存PVA的效果证明 ,在无菌条件下切取毒源马铃薯和毒源烟草茎尖 0 6～ 1cm ,在盛有MS培养基的试管中培养 ,或在试管中长至 10～ 12cm时切单节段更新试管培养 ,均可正常生长发育。利用电镜检测筛选出 5管PVA纯毒源材料进一步试验证明 ,在毒源马铃薯和毒源烟草生长发育的不同时期 ,植株内的PVA含量不同 ;毒源马铃薯和毒源烟草试管苗移入温室栽培可正常生长发育。接种指示植物证明 。

马铃薯A病毒不同分离物的侵染鉴定及致病力分析

马铃薯A病毒(Potato virus A,PVA)是马铃薯生产上较常见的病毒之一,植株感病症状与品种、病毒株系和环境条件有关。为研究PVA不同分离物对马铃薯的致病力,将3种遗传背景不同的PVA分离物纯毒源,分别接种到指示植物‘黄花烟’和马铃薯品种‘克新13号’上,应用qRT-PCR检测技术进行病毒侵染鉴定,并观察其致病性差异。结果表明,3种PVA分离物均可成功侵染‘黄花烟’和‘克新13号’,通过接种后‘黄花烟’叶片的症状表现,推断3种分离物的致病性具有一定差异。在马铃薯上分离物2017-171致病力表现为最强,不仅在植株体内病毒含量最高,可致使叶片出现叶缘皱缩、轻花叶,还能导致马铃薯块茎严重裂口、芽眼变深;其次是分离物KB117,病毒侵染速度较快但病毒含量低,植株症状相对明显,叶缘变尖、波浪状皱缩,块茎发生畸形且芽眼变深;最后是分离物2017-176,植株仅个别叶片呈现轻微叶缘皱缩,块茎未出现畸形只存在芽眼变深症状,病毒侵染速度相对慢但病毒含量居中。PVA不同株系的致病性分析为其有效防治提供了有价值的理论依据。

抗卷叶病毒（PLRV）转基因马铃薯栽培种及其抗病性研究

应用本室合成、克隆的马铃薯卷叶病毒（Ｐｏｔａｔｏｌｅａｆｒｏｌｌｖｉｒｕｓ，ＰＬＲＶ）中国分离株的外壳蛋白（ＣＰ）基因，通过致瘤农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）介导，以马铃薯叶园片为转化材料，转化了马铃薯Ｄｅｓｉｒｅｅ、Ｆａｖｏｒｉｔａ、虎头和乌盟６０１，并获得了上述四个栽培种的转基因植株，成功地建立了一种简单、快速和效率高的转化体系，卡那霉素抗性、ＰＣＲ扩增目的基因、Ｓｏｕｔｈｅｍ和Ｎｏｒｔｈｅｍｂｌｏｔ分析证明，ＰＬＲＶ外壳蛋白基因已经稳定整合进入转基因马铃薯的染色体组中，并在转录水平上得到表达。窄缝转移分析（Ｓｌｏｔｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ）表明，每个转化体四倍体基因组中含有１－５个ＣＰ基因拷贝。转基因植物的接种试验证明，转基因工程植株中的ＰＬＲＶ滴度比未转基因的对照植株显著低。蚜虫传播试验证明，转基因植株可减少蚜虫在田间传播ＰＬＲＶ的效率，限制了ＰＬＲＶ的传播，减少田间植物发病的机会。

用生物素标记外壳蛋白基因cDNA探针检测葡萄扇叶及马铃薯Y病毒

以葡萄扇叶病毒(GFV)干u马铃薯Y病毒(PVY)外壳蛋白基因的重组质粒为模板,用聚合酶链式反膨技术(PCR)分别合成了长度为1.5kb和0.75kb的生物素标记双链cDNA探针,在斑点杂交反应中,探针的最适使用浓度为1/100,GFV探针检测GFV-RNA的灵敏度为10pg,检测提纯GFV的灵敏度为25pg,检测感病苋色藜的最大稀释倍数为10000倍;PVY探针检测PVY-RNA的灵敏度为30pg,检测提纯PVY灵敏度为500pg,感病烟草检测的最大稀释度为8000倍,阴性对照均无杂交信号出现。

利用RNA介导的抗病性获得高度抗马铃薯Y病毒的转基因烟草

以马铃薯 Y病毒坏死株系 (PVYN)的 RNA为模板 ,应用反转录 -聚合酶链式反应 (RT- PCR)方法 ,扩增出长度为 80 1bp的非翻译的马铃薯 Y病毒外壳蛋白基因。将扩增的片段克隆到 p BSK的Bam HI和 Kpn I之间并进行了序列测定。用 Bam HI和 Kpn I从重组克隆载体上切下该基因并插入到质粒 p ROKII内得到植物表达载体 p PVYCP。通过根癌农杆菌 (LBA4 40 4 )介导的方法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选、PCR和 Southern blot检测 ,获得 82株转基因植株。 Northern blot和Western blot分析表明 ,转基因植株只在 RNA水平上得到了表达。抗病性试验表明转基因植株之间抗性水平存在着差异 ,其中有 7株是对 PVYN高度抗病性的植株。转基因植株抗病特异性试验初步表明 ,对 PVYN 表现高度抗病的植株对 PVYO 也具有高度抗病性。

马铃薯病毒一步法RT-PCR诊断研究

运用一步法RT-PCR对马铃薯和烟草中的马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒进行了检测,实验表明:对酚-SDS方法提取的病毒核酸进行扩增,一步法RT-PCR检测到的扩增产物的灵敏度较两步法RT-PCR的高100倍左右.两种提取方法对比,用一步法RT-PCR进行扩增,检测到的PEG法扩增产物的灵敏度较酚-SDS法扩增产物的灵敏度高3倍.建立了快速、简便、灵敏度高、特异性强的马铃薯病毒一步法RT-PCR检测技术.

中国马铃薯主要病毒病发生情况调查与分析

马铃薯病毒病是造成马铃薯减产的主要因素,为了解中国马铃薯种薯质量及生产中病毒病发生情况,在马铃薯主产区黑龙江、内蒙古、甘肃、河北等地采集具有典型病毒病症状的样品、疑似病毒样品和随机无症样品,包括试管苗样品248个,原原种样品93个,大田种薯样品621个,共计962个。应用DAS-ELISA方法检测6种马铃薯主要病毒:PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM和PVA。结果表明,219份样品病毒检测结果呈阳性,PVS检出率最高,PVY次之。有10个样品是由多种病毒复合侵染造成。不同级别种薯质量情况为试管苗PVS病毒发生较多,原原种质量较好,大田种薯PVY病毒发生比例最高。

西南地区与东北地区马铃薯主要病毒发生比较

通过对西南地区和东北地区马铃薯脱毒试管苗、原原种和马铃薯生产田样品检测,比较南北地区马铃薯病毒发生情况,了解病毒发生特点。结果表明,南方马铃薯田PVX病毒发生严重,北方马铃薯田PVY病毒发生严重,现阶段西南与东北两地的马铃薯种薯生产核心材料脱毒试管苗和原原种质量都不高。

CP基因3'端短片段介导的对马铃薯Y病毒的抗性

目的探明马铃薯Y病毒脉坏死株系(PVYN)CP基因3′端序列短片段的不同结构转基因诱导转基因植物产生RNA介导抗性的有效性。方法以PVYN的CP基因cDNA3′端202bp片段构建非翻译的正向重复和反向重复结构的植物表达载体转化烟草。结果攻毒试验表明前者没有一例转基因植株表现为抗病,而转化反向重复结构的转基因植株82.8%表现近似免疫的高度抗病型,Southern印迹杂交证明目的基因已整合到烟草基因组,Northern印迹杂交结果显示反向重复结构转基因植物的抗病性与RNA的表达量呈现负相关。结论抗病性是RNA介导的病毒抗性。3′端短片段诱导产生的转基因抗病株比例比5′端短片段诱导产生的高。

马铃薯A病毒CP基因的克隆与序列分析

利用根据马铃薯A病毒 (PVA)外壳蛋白 (CP)基因序列设计合成的一对引物 ,以带毒植物总RNA为模板 ,RT-PCR扩增得到长 0 8kb的目的片段。将目的片段转入大肠杆菌并进行了序列测定。测序结果与PVA其他分离物CP基因序列比较 ,发现其核苷酸同源性最高可达 99%。

中国马铃薯Y病毒的检测鉴定及CP基因的分子变异

【目的】查明马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)病在中国的发生情况,及时、准确地鉴定出PVY并对其分子变异进行分析。【方法】采用ELISA方法对采自中国14个省(直辖市)马铃薯种植区疑似受PVY感染的样品进行了检测,并对其中的部分材料镜检验证,然后根据CP基因序列设计1对简并引物针对随机选择感染PVY的14个省(直辖市)代表样品进行CP基因扩增克隆,将测序得到的序列进行分子变异分析,并使用贝叶斯法(Bayesian inference,BI)重建系统发育关系。【结果】ELISA检测结果表明,691份样品中220个样品与PVY抗体呈阳性反应,其余呈阴性反应;ELISA检测的阳性材料在透射电镜下均可观察到明显的风轮状内含体,14个PVY分离物均成功扩增出预期大小(约800 bp)的特异性片段,CP基因的核苷酸序列与已报道PVY不同株系的核苷酸序列一致性均在88%以上;在14个PVY分离物CP基因中共发现有29个多态性位点,其中6个简约信息位点,23个单一变异位点。系统发育分析结果显示,14个PVY分离物与PVYN:O株系相聚成簇,表明其在系统发育关系上,与PVYN:O株系的亲缘关系最近。【结论】PVY CP基因高度保守,但不同地区分离物也存在一定的分子变异,本研究可为今后了解PVY病毒病流行、变异趋势及其防治提供依据。

马铃薯主产区病毒病发生情况调查分析

在我国马铃薯主产区黑龙江、内蒙古、甘肃、贵州采集了752份具有典型病毒病症状的样品和疑似样品,应用DAS-ELISA方法进行检测。主要筛查6种病毒:PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM、PVA。结果显示:270份样品检测到病毒,总体上,PVY的检出率最高,PVS次之,33份样品是由多种病毒混合侵染造成的,田间PVY+PLRV混合侵染率最高,PVS+PVY次之。试管苗PVS病毒发生较多,原原种和大田种薯PVY病毒发生比例最高。