马铃薯X病毒分子生物学研究进展及其作为表达载体的应用

马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)又称马铃薯潜隐病毒(Potato latent virus)或马铃薯轻花叶病毒(Potato mild mosaic virus),是马铃薯X病毒属(Potexvirus)的模式成员,遍布于全世界马铃薯种植区.受侵染叶片呈花叶症状,田间常与其他病毒混合感染导致马铃薯的毁灭性减产.

马铃薯X病毒外壳蛋白基因片段的瞬时表达诱导对PVX的高抗性(英文)

为获得抗马铃薯X病毒(PVX)的植株,从疑似感染马铃薯X病毒的马铃薯叶片中提取出PVXcp cDNA,将其保守片段插入到RNAi质粒pHellsgate12中以构建编码发夹结构RNA的载体,通过Agroinfiltration的方法在本氏烟植株中瞬时表达。结果表明:病毒侵染10d后,15株引入该载体的本氏烟植株对PVX均具有抗性,此载体可用于产生对马铃薯X病毒具有高抗性的转基因植物。

马铃薯X病毒外壳蛋白基因的克隆及其原核表达载体的构建

将来源于国际马铃薯中心 (InternationalPotatoCenter ,ClP)PVX病毒毒源接种至烟草上 ,对表现明显症状的烟草叶片提取马铃薯病毒X (PVX)总RNA ,人工合成引物P1、P2 ,通过RT PCR扩增合成PVX cp的cDNA ,井将其克隆到pGEM T载体上。经限制酶谱分析后进行全序列测定 ,结果表明 :该基因由 714个核苷酸组成 ,编码 2 38个氨基酸 ,与文献 (分别来源于亚洲、非洲和欧洲 )报道的 4个 pVX cp基因相比同源性为 81%～ 95 % ,其编码的氨基酸同源性均在 90 %以上。说明PVX cp具有较高的保守性。用内切酶将PVX cp基因自克隆载体 pGEM切下 ,定向插入到表达质粒 pBV2 2 0的启动子Pr、Pl的下游 ,构建了该基因的原核表达载体pBV pvx ,为进行该基因的原核表达和抗血清的制备奠定了基础。

马铃薯X病毒CP基因的原核表达及特异性抗血清的制备

依据马铃薯X病毒(PotatovirusX,PVX)外壳蛋白(CP)基因序列(711bp)设计合成了两对引物,通过RT-PCR扩增得到长0.7bp的目的片段.将目的片段转入大肠杆菌,酶切鉴定证明得到了含有目的片段的重组子,测定序列结果与其他PVX分离物CP基因序列比较,发现其核苷酸同源性最高可达99%左右,证明此病毒为PVX.构建了含PVXCP基因的融合蛋白原核表达载体,并在大肠杆菌中得到表达,SDS-PAGE测定该融合蛋白GST-XCP的相对分子质量为52000.Westemblot分析结果显示,GST-XCP与PVX抗血清有很强的免疫反应,表明GST-XCP有天然状态下病毒核衣壳蛋白的抗原性.制备了GST-XCP抗血清,并利用此抗血清建立了PVX的间接ELISA检测方法,检测灵敏度为1mg鲜重的病株叶片.

瞬时表达比较马铃薯X病毒CP基因3种结构对RNA沉默的诱导效果

RNA沉默是植物抵御病毒侵染的一种防卫机制,病原来源的抗性(pathogen-derived resistance,PDR)被认为是通过RNA沉默起作用的.转化的核酸片段在基因组中的位置、长短和不同排列结构等均影响RNA沉默的效率.用全长马铃薯X病毒(PVX)CP基因构建非翻译的正义、反义和反向重复结构转基因的植物表达载体,通过农杆菌渗入法瞬时表达测试了这些转基因对RNA介导抗性的诱导效率和有效性.结果表明,反向重复的PVXCP是更为有效的RNA沉默诱导因子,同时也证明让目的基因在受试植物中瞬时表达,在转化植物之前能比较快速地检测转基因的表达情况以及表达产物的功能,从而节约时间和资源,并减少盲目性.

马铃薯X病毒外壳蛋白的表达水平与变偶密码子使用频率的相关性

把经密码子修饰的马铃薯X病毒 (PotatoVirusX ,PVX)外壳蛋白 (CoatProtein,CP)基因和未修饰的野生型外壳蛋白基因与CaMV 3 5S启动子融合后 ,构建成相应的植物表达载体 ,利用农杆菌介导转化烟草。分别对修饰CP和野生CP的转基因烟草进行Westernblot和ELISA分析 ,结果表明经密码子修饰的PVX外壳蛋白的表达量是野生型蛋白表达量的 1 3～1 5。Northernblot结果表明修饰和未修饰的外壳蛋白在转录水平上是一致的。以上结果暗示外源基因中稀有密码子的数量可能是限制外源基因表达的一个因素。

重组马铃薯X病毒载体介导的烟草γ-微管蛋白基因沉默

用重组马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)载体将γ-微管蛋白反义基因导入烟草(Nicotiana tabacum var.Samsun NN),得到了γ-微管蛋白基因沉默的烟草植株。它与侵染PVX空载体的正对照相比有明显的差异:不同形态的叶片分层交替生长;到生殖期所有的花苞都提前脱落;小孢子不能发育到四分体阶段。沉默的形态反应主要起始于顶端幼嫩组织。在沉默过程中除存在基因沉默及恢复现象外还出现靶基因水平的陡然升高,甚至有时会明显反超过正常对照水平。

马铃薯S病毒CP基因原核表达载体的构建

以质粒pGEM-pvs为模板,经PCR扩增得到了长约890bp的PVS-CP基因条带。回收特异性DNA带并与T表达载体pBAD/Thio-TOPO连接,连接物转化受体菌获得了Amp抗性菌落。经PstⅠ、SphⅠ酶切鉴定,筛选到了PVS-CP基因正向插入载体的阳性克隆。DNA测序结果表明PVS-CP基因插入方向与读码正确,成功构建了PVS-CP基因的原核表达载体。经阿拉伯糖诱导获得了预期的49kDa融合蛋白,PVS-CP基因在受体菌中表达正确。

利用原核表达的衣壳蛋白制备马铃薯X病毒的抗血清

本研究构建了含马铃薯X病毒(PVX)衣壳蛋白(CP)基因的原核表达载体,利用在大肠杆菌内表达的马铃薯X病毒CP制备了效价为1∶1 600的抗血清。该血清可用于马铃薯、番茄、辣椒和烟草等作物携带PVX情况的检测。

马铃薯X病毒外壳蛋白基因的原核表达及多克隆抗体的制备

采用RT-PCR技术从感染马铃薯X病毒贵州分离物PVX-GZ的普通烟叶片中扩增出该病毒的外壳蛋白基因CP。测序结果表明,该CP基因全长714 bp,编码237个氨基酸残基。构建原核表达载体p ET32a(+)-CP,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在25℃条件下以0.6 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-Dthivgalactopyranoside,简称IPTG)诱导表达重组蛋白基因;SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子量约为45 ku;以该重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备的抗体效价达1∶12 800;间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunsorbent assay,简称ELISA)检测显示,该多抗能与PVX病叶汁发生特异性免疫反应,而与其他5种同属或不同属病毒叶汁无血清学交叉反应。结果为病毒血清学检测试剂盒的研发奠定了基础。

马铃薯卷叶病毒缺失突变CP基因酿酒酵母表达载体的构建

以重组质粒pBAD-LRCP-126为模板,经PCR扩增获得了PLRV缺失突变CP基因的特异性条带。目的片段与pYES2.1/V5-His/-TOPO的连接产物转化大肠杆菌TOP10F′获得了氨苄青霉素抗性菌落,酶切与DNA测序结果确认了酵母表达载体的正确性,该表达载体命名为pYES-LRCP-126。在30℃,酿酒酵母工程菌株INVSc1(pYES-LRCP-126)经2%半乳糖诱导培养16h,SDS-PAGE显示蛋白图谱上有一条23kDa的诱导表达的蛋白条带,其大小与预期的重组CP大小相符,表明PLRV缺失突变基因在酵母菌中实现了表达。

利用马铃薯X病毒表达载体在植物中表达非洲猪瘟病毒p30蛋白

由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的非洲猪瘟疫病(ASF)具有极高发病率和致死率,是我国一类动物疫病,对我国养猪产业造成重大威胁和巨大经济损失。p30蛋白是ASFV最主要结构蛋白之一,具有强烈免疫原性,是ASFV疫苗研发重要靶标。利用马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)侵染性克隆,构建表达p30蛋白重组PVX载体,通过农杆菌浸润法验证在模式植物本氏烟中表达p30蛋白可行性。结果表明,重组PVX载体接种本氏烟后5 d,植株系统叶片出现花叶症状;接种11 d后,植株系统叶片明显坏死。RT-PCR和Western blot检测表明p30蛋白在本氏烟中成功表达。研究结果为进一步规模化生产植物源p30蛋白奠定坚实基础。

马铃薯单双三价抗病毒基因表达载体的构建

马铃薯Y病毒(PVY)、X病毒(PVX)和卷叶病毒(PLRV)引起的病害是造成我国马铃薯退化的主要原因,严重危害我国的马铃薯生产。PVY和PVX或PVY和PLRV混合侵染带来的损失远远大于各病毒单独侵染。国外科学家通过在马铃薯植株体内表达病毒外壳蛋白(CP)基因来减缓病毒病害的发生已取得相当的成功。 我们从河北省坝上地区农科所试验田中采集PLRV感病材料Burbank及87-1,参照文献提取病毒RNA并以其为模板,反转录合成cDNA。根据PLRV澳大利亚分离物已发表的序列。

乙型肝炎病毒X基因酵母表达载体构建及表达

目的:为进一步探讨乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)的功能,在真核生物酵母细胞中表达X基因。 方法:用多聚酶链反应(PCR)的方法以HBV ayw亚型全序质粒pCP10为模板扩增X基因,克隆到pGEM-T载体中扩增并测序鉴定,EcoRI和PstI双酶切后回收连接到酵母表达载体pGBKT-7中并转化酵母AH109,色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落,提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹分析,以明确HaxAg是否在其中表达。 结果:成功地扩增出HBx基因,测序鉴定符合Gene Bank报告序列;酶切回收的HBx基因成功地克隆入酵母表达载体pGBKT-7并转化入酵母细胞AH109中,Western免疫印迹显示X基因在酵母细胞中表达,表达产物在胞内存在,相对M_r为35000左右。 结论:成功地构建了HBxAg在酵母表达载体,并在酵母细胞中表达。

乙肝病毒X基因真核表达载体的构建及人肝细胞株HL-7702转染

目的:构建表达乙肝病毒(HBV)X基因的人肝细胞株. 方法:用PCR法扩增HBVX基因序列,将其添A后连至PUCmT载体上,用EcolⅠ和Hind Ⅲ双酶切PUCmT-X和PcDNA3载体,连接酶切片段PcDNA3及X片段以构建重组质粒PcDNA3-X.用脂质体转染法将PcDNA3-X及空质粒PcDNA3导入肝细胞HL-7702中,G418选择培养,RT- PCR鉴定其稳定表达. 结果:已构建的PcDNA3-X经序列测定含有完整的HBV X 基因片段,转入HL-7702细胞后经RT-PCR证实该细胞有稳定表达X蛋白. 结论:成功构建了表达HBV X基因的肝细胞株,为进一步探讨HBV X基因在肝炎与肝癌发生中的作用提供了理想的实验模型.

脱毒马铃薯X病毒再侵染及运转速度研究

将马铃薯X病毒(PVX) 分别接种于脱毒马铃薯不同大小植株刚展开的心叶上,7 天、17 天及28 天后取样检测植株各部位病毒含量,结果表明,接种7 天后病毒开始运转,17 天后所有被检测的植株匍匐茎或块茎中都发现了病毒,且其含量较高,其次是心叶( 包括生长点) 和接种叶片。病毒含量的高低与接种时植株的大小密切相关,植株越小,匍匐茎、块茎和心叶中病毒含量越高。由此可见,病毒在植株体内的运转部位,主要是生长速度快的匍匐茎、块茎和心叶及生长点。

乙型肝炎病毒X基因cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的为研究HBV X基因(HBx)与原发性肝细胞癌发生的关系,克隆HBx的cDNA并构建HBx真核表达载体。方法利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从HepG2.2.15细胞中扩增出HBx的cDNA,克隆到质粒PCDNA3.1中。结果RT-PCR扩增出约460 bp片段,经酶切鉴定显示HBx的cDNA真核表达载体(HBx-PCDNA3.1)构建成功,测序结果显示HBx的cDNA与已发表的的序列相同。结论成功地构建了HBx的真核表达载体HBx-PCDNA3.1。

乙肝病毒X基因真核表达载体的构建及表达

目的:探讨HBVX基因在肝癌发生中的作用,并构建含X基因真核表达质粒。方法:用PCR法扩增含EcoRⅠ与PstⅠ酶切位点的X基因序列,对PAS21载体及X基因PCR产物经双酶切,用连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌JM105,对重组质粒经序列测定,称PAS21X。用乙酸锂转化法将重组质粒转化入酵母菌AH109,经Westernblot法证实重组质粒在酵母细胞中的表达。结果:已构建的质粒PAS21X经序列测定含有完整的X基因片段,转入酵母后经Westernblot证实酵母细胞表达X蛋白。结论:PAS21X表达载体是为了解X基因与X蛋白的致癌机制而构建,为通过酵母双杂交体系筛选体内与X蛋白相互作用的X相关蛋白奠定了基础。

乙型肝炎病毒P和X区siRNA表达载体的构建与鉴定

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)P区和X区的小干扰RNA(siRNA)表达载体,并进行酶切鉴定,为进一步评价siRNA对HBV的抑制作用提供研究基础。方法根据siRNA的设计原则并经Blast比对,设计合成6条siRNA双链复合体,体外退火后在T4连接酶作用下连接入重组载体PSilencercmv4.1hygro,连接产物转化JM109感受态细胞,筛选阳性克隆并提取重组体,经琼脂糖凝胶电泳初步鉴定,酶切产物经聚丙稀酰胺凝胶电泳确定插入片段,送公司测序鉴定。结果琼脂糖凝胶电泳得到与质粒大小相近的条带,聚丙稀酰胺凝胶电泳确定已插入大小约55bp的双链DNA片段,测序结果证实重组载体构建成功。结论构建的HBV的siRNA表达载体可用于进一步检测其对病毒的抑制作用。

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建含有天然完整的乙型肝炎病毒(HBV)X基因序列的真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达。方法:设计并合成HBV X基因的引物,用PCR方法从含完整HBV全基因的HepG2细胞中扩增X基因序列,并将其连接到真核表达载体pVAX-1上,酶切、PCR鉴定;用Triton X-114去除质粒内毒素后,采用电穿孔法将重组质粒pVAX-HBV X和空质粒pVAX-1分别转染SMMC-7721细胞,RT-PCR法检测HBV X基因mRNA的表达,Western印迹鉴定HBV X蛋白(HBx)的表达。结果:酶切和PCR鉴定证实pVAX-HBV X载体中包含完整的HBVX基因片段,该重组质粒转染的SMMC-7721细胞中HBV X基因mRNA及HBx蛋白的表达稳定。结论:构建了HBV X基因的真核表达载体,为X基因及其编码蛋白的生物学功能的研究提供了可靠的基因材料。