河北保定地区黄瓜花叶病毒与马铃薯Y病毒复合侵染叶用莴苣分子鉴定

利用RT-PCR方法对采集自河北保定地区的疑似叶用莴苣病毒病样品进行分子生物学鉴定,并构建系统发育进化树。结果表明,特异性引物CMV和PVY分别扩增得到大小为260、420 bp的单一条带;通过核苷酸序列Blast比对及系统进化树分析,河北保定地区叶用莴苣病毒分离物分别与印度番茄CMV分离物(MN514839.1)、印度马铃薯PVY分离物(JX945850.1)聚在同一分支上,同源性分别为95%、92%。本研究首次检测到河北保定地区叶用莴苣病毒病是由CMV与PVY复合侵染所致。

马铃薯Y病毒属病毒6K2蛋白叶绿体定位的机制解析

【目的】明确影响马铃薯Y病毒属病毒6K2蛋白叶绿体定位的结构域。【方法】6K2蛋白分为N端结构域、中间跨膜结构域与C端结构域,分别将6K2蛋白N段结构域、跨膜结构域、C段结构域缺失突变,构建6K2^(PVYΔN)、6K2^(PVYΔC)、6K2^(PVYΔNΔC)、6K2^(TuMVΔN)、6K2^(TuMVΔC)、6K2^(TuMVΔNΔC)突变体。将6K2PVY与6K2^(TuMV)跨膜区的GxxxG基序分别突变,构建6K2PVY GV、6K2^(TuMV)GV突变体,通过激光共聚焦显微镜观察不同6K2-RFP突变体亚细胞定位。将PVY与TuMV编码的6K2蛋白不同结构域重组,构建6K2^(PPT)、6K2^(PTT)、6K2^(TPT)、6K2^(TTP)、6K2^(TPP)、6K2^(PTP)重组蛋白,观察不同6K2-RFP重组蛋白的亚细胞定位。【结果】6K2^(TuMV),突变体6K2^(TuMVΔN)、6K2^(TuMVΔC)、6K2^(TuMVΔN)ΔC、6K2^(PVYΔC)、6K2^(PVYΔNΔC),重组蛋白6K2^(PPT)、6K2^(PTT)、6K2TPT定位于叶绿体。6K2PVY,突变体6K2^(PVYΔN),重组蛋白6K2^(TTP)、6K2^(TPP)、6K2^(PTP)不定位于叶绿体。【结论】马铃薯Y病毒属病毒6K2蛋白的跨膜结构域决定其叶绿体定位,而6K2^(PVY)的C端结构域干扰其叶绿体定位,6K2^(PVY)与6K2^(TuMV)的C端结构域的差异导致了其不同亚细胞定位。

β-氨基丁酸诱导马铃薯Y病毒抗性及信号转导途径研究

马铃薯Y病毒(PVY)是目前马铃薯、烟草等作物生产过程中危害最严重的病毒病之一,严重影响作物产量和品质。为探究β-氨基丁酸(BABA)对植物PVY抗性的诱导作用,以烟草品种Samsun为试验材料,通过对叶面喷施BABA,探究BABA对烟草PVY抗性的诱导作用及信号转导途径。结果表明,叶面喷施BABA可有效诱导烟草对PVY的抗性,其中5 mmol/L BABA对烟草PVY抗性诱导效果最明显。与对照相比,对感染PVY的植株喷施5 mmol/L BABA可以使叶片明脉推迟3~4 d出现,同时抑制由PVY引起的茎部坏死程度,经qRT-PCR测定发现,在接种病毒第5、7、10、14天的植株中,BABA处理组对PVY表达量的抑制率相较于对照组分别达到98.70%、96.62%、98.40%、66.89%,病理症状观察结果与分子检测结果相符合。通过高效液相色谱外标法对样品提取液进行分析发现,5 mmol/L BABA处理可诱导烟草内源水杨酸(SA)含量的峰值出现时间早于PVY病毒表达量峰值的出现时间,并有效调节烟草植株内活性氧动态平衡。通过qRT-PCR和H_(2)O_(2)原位表征测定得出,BABA处理在激活防御体系时,通过抑制相关抗氧化酶CAT的基因表达量,使H_(2)O_(2)在植株内适量积累,可在诱导抗性的同时降低H_(2)O_(2)对植株的毒害作用。结果表明,BABA对PVY的抗性诱导与SA作为信号分子参与诱导植株防卫基因表达过程存在紧密相关性。

含氟异喹啉二酮衍生物的合成及其抗马铃薯Y病毒活性分析

为了探索更高抗植物病毒活性的新药物分子,采用较廉价的原料、较温和的反应条件合成了12个含氟基团异喹啉二酮衍生物,并采用半叶枯斑法对合成的目标化合物进行抗马铃薯Y病毒(PVY)活性测定。结果表明:含氟异喹啉二酮衍生物对马铃薯Y病毒(PVY)具有较好的抑制活性,其中化合物3e的治疗活性(43.5%)、保护活性(47.1%)、钝化活性(51.9%)都表现出较好的效果,与阳性对照农用抗病毒药物病毒唑活性相当,在其结构基础上进行一定的结构修饰,有望得到具有更高抗病毒活性的化合物。

不同药剂对鄂西北烟草马铃薯Y病毒病的防治效果

为探究鄂西北烟区有效的烟草马铃薯Y病毒病防治药剂,降低烟叶种植病害损失,采用随机区组试验设计方法,以鄂西北烟区竹山县、竹溪县2处试验地为例,开展20%琥铜·吗啉胍可湿性粉剂、8%宁南霉素水剂、20%吗胍·乙酸铜可湿性粉剂3种药剂对烟草马铃薯Y病毒病的防效试验。结果表明,3种供试药剂对烟草马铃薯Y病毒病均具有一定的防控作用,但在病前预防和病后防治效果上有一定差异。从预防效果看,20%吗胍·乙酸铜预防效果最好,3次施药,预防效果可达57.45%;其次是20%琥铜吗啉胍,3次预防效果为53.19%,预防在揭膜培土后施药为宜。从防治效果看,20%琥铜·吗啉胍防治效果最好,病后防治3次防治效果高达73.35%,明显高于其他2种药剂;其次是8%宁南霉素,3次防治后效果为53.18%。在生产实践中,可采用20%吗胍·乙酸铜和20%琥铜·吗啉胍结合用药,其中20%吗胍·乙酸铜用于发病前的预防,20%琥铜·吗啉胍用于发病后的防治;8%宁南霉素3个处理防治效果均在50%以上,也可以考虑作为防治鄂西北烟草马铃薯Y病毒病毒病药剂。

湘西州烟草马铃薯Y病毒病的调查分析

为了解湘西土家族苗族自治州烟区烟草马铃薯Y病毒病发生规律,对湘西州7个植烟县烟草马铃薯Y病毒病发生情况开展调查,揭示了湘西州马铃薯Y病毒病的发病规律及特点,并从强化队伍建设、科学栽培管理2个方面提出了有效防治烟草马铃薯Y病毒病的措施,以期为减少烟草生产损失提供参考。

中国马铃薯Y病毒的检测鉴定及CP基因的分子变异

【目的】查明马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)病在中国的发生情况,及时、准确地鉴定出PVY并对其分子变异进行分析。【方法】采用ELISA方法对采自中国14个省(直辖市)马铃薯种植区疑似受PVY感染的样品进行了检测,并对其中的部分材料镜检验证,然后根据CP基因序列设计1对简并引物针对随机选择感染PVY的14个省(直辖市)代表样品进行CP基因扩增克隆,将测序得到的序列进行分子变异分析,并使用贝叶斯法(Bayesian inference,BI)重建系统发育关系。【结果】ELISA检测结果表明,691份样品中220个样品与PVY抗体呈阳性反应,其余呈阴性反应;ELISA检测的阳性材料在透射电镜下均可观察到明显的风轮状内含体,14个PVY分离物均成功扩增出预期大小(约800 bp)的特异性片段,CP基因的核苷酸序列与已报道PVY不同株系的核苷酸序列一致性均在88%以上;在14个PVY分离物CP基因中共发现有29个多态性位点,其中6个简约信息位点,23个单一变异位点。系统发育分析结果显示,14个PVY分离物与PVYN:O株系相聚成簇,表明其在系统发育关系上,与PVYN:O株系的亲缘关系最近。【结论】PVY CP基因高度保守,但不同地区分离物也存在一定的分子变异,本研究可为今后了解PVY病毒病流行、变异趋势及其防治提供依据。

翻译和非翻译马铃薯Y病毒外壳蛋白基因介导的抗病性比较

利用RT PCR方法克隆获得马铃薯Y病毒烟草叶脉坏死株系 (PVYN)的可翻译和不可翻译外壳蛋白 (CP)基因 ,并分别插入 pROKⅡ质粒中获得重组双元表达载体。通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens) 介导的基因转化方法 ,将可翻译和不可翻译的PVYN CP基因分别导入烟草栽培品种NC89叶片组织中 ,得到抗卡那霉素的再生植株。对所得到的抗卡那霉素的再生苗进行PCR检测表明 ,被导入可翻译和不可翻译CP基因的植株分别占卡那霉素抗性植株的 95 %和 98%。攻毒实验表明 ,两种类型的转基因烟草对PVYN 的抗病性具有相似性 ,其表现型为 :免疫、抗病和感病。免疫型转基因植株的抗病性不受接种物类型及其剂量的影响。Southern印迹杂交结果显示 ,目的基因已经整合到烟草基因组中。Northern印迹杂交证明 ,两种类型的CP基因都已在RNA水平上得到了表达 ,但细胞内RNA的积累量与转基因植株的抗病强度成负相关。Western印迹杂交表明 ,在表达不可翻译PVYN CP基因的转基因植株内未检测到CP蛋白 ,而在导入可翻译的PVYN CP基因的植株内检测到了CP蛋白 ,且CP蛋白含量与抗病性不存在正相关。本研究结果证明 ,表达可翻译与不可翻译PVYN CP基因的转基因烟草对PVYN 的抗病性均为RNA介导的抗病性。

利用RNA介导的抗病性获得高度抗马铃薯Y病毒的转基因烟草

以马铃薯 Y病毒坏死株系 (PVYN)的 RNA为模板 ,应用反转录 -聚合酶链式反应 (RT- PCR)方法 ,扩增出长度为 80 1bp的非翻译的马铃薯 Y病毒外壳蛋白基因。将扩增的片段克隆到 p BSK的Bam HI和 Kpn I之间并进行了序列测定。用 Bam HI和 Kpn I从重组克隆载体上切下该基因并插入到质粒 p ROKII内得到植物表达载体 p PVYCP。通过根癌农杆菌 (LBA4 40 4 )介导的方法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选、PCR和 Southern blot检测 ,获得 82株转基因植株。 Northern blot和Western blot分析表明 ,转基因植株只在 RNA水平上得到了表达。抗病性试验表明转基因植株之间抗性水平存在着差异 ,其中有 7株是对 PVYN高度抗病性的植株。转基因植株抗病特异性试验初步表明 ,对 PVYN 表现高度抗病的植株对 PVYO 也具有高度抗病性。

马铃薯Y病毒两分离物特性及其侵染寄主的超微结构比较研究

报道了马铃薯 Y病毒两分离物的生物学和血清学特性、病毒粒体形态大小以及它们引起的寄主细胞病变特征等方面的差异。从山东省主要烟草和马铃薯种植区病毒样品中分离到两个马铃薯 Y病毒分离物 ,分别为 PVY- T和 PVY- P。两分离物在寄主植物上的症状表现、体外抗性、蚜传特性、血清学以及病毒粒体大小等方面存在着明显的差异。同时 ,这些结果与作对照的 PVY标准株系 PVYN和PVYO相比较 ,初步推测分离物 PVY- T属于 PVYO 株系 ,而 PVY- P则属于 PVYN。通过对受侵染寄主的细胞超微结构观察比较发现 ,这两种 PVY分离物在寄主细胞内的分布特征、内含体以及与寄主互作后所引起的细胞病变也明显不同 ,这些可能成为区别 PVY不同株系的依据之一。

正向和反向重复RNA介导的抗马铃薯Y病毒基因工程比较研究

RNA介导的病毒抗性与RNA沉默现象密切相关。反向重复cDNA序列(IR)的转录产物往往形成双链RNA结构,而双链RNA是诱发RNA沉默的有效因子。据此,本研究通过体外合成马铃薯Y病毒坏死株系衣壳蛋白基因(PVYN-CP)5'端反向重复cDNA序列和正向重复cDNA序列(DR),分别构建植物表达载体pROK-IR和pROK-DR,利用农杆菌介导方法转化烟草NC89,比较这2种转基因烟草在RNA介导抗病性方面的差异。抗病性检测表明,转化IR和DR的转基因烟草均可获得抗病程度达到免疫的植株,但转化IR序列可大大提高抗病植株在转基因植株中的比例。分析结果表明所获得的抗病性为RNA介导的抗病性,是RNA沉默的结果。这一研究结果为利用IR策略进行抗病毒遗传育种提供了理论依据,并为讲一步开展RNA介导抗病性的机制研究奠宗了基础。

CP基因3'端短片段介导的对马铃薯Y病毒的抗性

目的探明马铃薯Y病毒脉坏死株系(PVYN)CP基因3′端序列短片段的不同结构转基因诱导转基因植物产生RNA介导抗性的有效性。方法以PVYN的CP基因cDNA3′端202bp片段构建非翻译的正向重复和反向重复结构的植物表达载体转化烟草。结果攻毒试验表明前者没有一例转基因植株表现为抗病,而转化反向重复结构的转基因植株82.8%表现近似免疫的高度抗病型,Southern印迹杂交证明目的基因已整合到烟草基因组,Northern印迹杂交结果显示反向重复结构转基因植物的抗病性与RNA的表达量呈现负相关。结论抗病性是RNA介导的病毒抗性。3′端短片段诱导产生的转基因抗病株比例比5′端短片段诱导产生的高。

马铃薯Y病毒单克隆抗体的制备及其检测应用

马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是危害农作物的重要病毒之一,在全球广泛传播并造成了严重的经济损失,而建立特异、灵敏的检测技术是防控PVY的关键。本研究以提纯PVYN病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得4株能分泌PVY单克隆抗体的杂交瘤细胞株(3B2、3E4、20B2和25C2),杂交瘤细胞分泌的腹水单抗的效价在10^(-6)~10^(-7)之间,Western blot分析发现3B2、3E4和20B2这3株单抗仅与感染PVY的叶片中1条分子质量约为30ku的蛋白有特异性反应。该蛋白的分子质量与PVY的外壳蛋白亚基大小相符,推测制备的这3个单抗能识别PVY的外壳蛋白亚基,而25C2单抗与感染PVY的病叶组织中约55ku的蛋白有特异性反应。进而以制备的单抗为核心建立了检测植株中PVY的ACP-ELISA、dot-ELISA、tissue blot-ELISA和IC-RTPCR这4种血清学方法。特异性分析结果表明,这4种血清学方法检测感染PVY的样品呈阳性反应,而检测健康的烟草和马铃薯及感染马铃薯S病毒、马铃薯X病毒、马铃薯卷叶病毒、马铃薯A病毒的样品呈阴性反应;灵敏度分析结果表明,ACP-ELISA和dot-ELISA检测马铃薯病叶的灵敏度分别达1∶81 920倍和1∶10 240倍稀释(g/mL),而具有最高检测灵敏度的IC-RT-PCR方法在感病植物组织稀释到1∶5 242 880倍(g/mL)时仍能检测到病毒。用建立的血清学方法对2015年采自云南的30个田间马铃薯样品进行检测,结果发现其中有20样品感染PVY,且血清学方法的检测结果与RT-PCR结果一致。抗PVY特异、灵敏单抗的制备及血清学检测方法的建立,为我国作物上PVY的检测和诊断、脱毒种薯生产、抗病育种和科学防控提供了物质和技术支撑。

烟草感染马铃薯Y病毒脉坏死株系后六种酶活性变化的研究

本文定期测定了感病品种ＮＣ８９接种ＰＶＹＮ后叶片内６种酶活性的动态变化，结果表明，接种后１４天内ＳＯＤ活性均较对照增高，其中第８天达高峰值，但接种后第１６天ＳＯＤ活性低于对照约２８％；ＡＡＯ活性在接种后２～６天明显高于对照，６～１２天，ＡＡＯ活性变化不定，但１２天后，ＡＡＯ活性又升高；ＰＯＤ活性在接种后２～４天比对照降低，４天后显著升高，至接种后第１４天达高峰值，接种后１６天又有下降趋势；ＣＡＴ活性仅在接种后第２天比对照略有升高，随后均低于对照，其中第６天和第１０天ＣＡＴ活性降低幅度较大；ＰＡＬ活性在接种后２～６天均比对照高，随后开始下降，第８～１０天ＰＡＬ活性低于对照，１０天后又升高，第１２天又达高峰值；ＰＰＯ活性在接种后２～１６天明显高于对照。本文还详细讨论了上述６种酶与烟草脉坏死病病程的相关性。

用生物素标记外壳蛋白基因cDNA探针检测葡萄扇叶及马铃薯Y病毒

以葡萄扇叶病毒(GFV)干u马铃薯Y病毒(PVY)外壳蛋白基因的重组质粒为模板,用聚合酶链式反膨技术(PCR)分别合成了长度为1.5kb和0.75kb的生物素标记双链cDNA探针,在斑点杂交反应中,探针的最适使用浓度为1/100,GFV探针检测GFV-RNA的灵敏度为10pg,检测提纯GFV的灵敏度为25pg,检测感病苋色藜的最大稀释倍数为10000倍;PVY探针检测PVY-RNA的灵敏度为30pg,检测提纯PVY灵敏度为500pg,感病烟草检测的最大稀释度为8000倍,阴性对照均无杂交信号出现。

表达马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的转基因烟草抗病机制

根据已报道的马铃薯Y病毒坏死株系 (PVYN)核苷酸序列 ,克隆了PVYN外壳蛋白 (CP)基因 ,通过根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)LBA4 4 0 4介导的方法 ,转化烟草NC89,获得了 38株PCR呈阳性的转基因植株 .攻毒试验发现 ,转基因植株对PVYN的抗性水平存在着差异 ,其中有 4株表现为高度抗病性 .Southernblot表明 ,PVYN CP基因已经整合到烟草染色体中 ,转基因的拷贝数与植株的抗病性成正相关 .Northernblot表明 ,PVYN CP基因在RNA水平上得到了表达 ,而且PVYNCPRNA在细胞中的积累量与转基因植株的抗病性呈明显的负相关 .Westernblot表明 ,高度抗病植株未检测到转基因CP蛋白质 ,而抗病和感病植株都检测到了PVYN CP蛋白 ,且不同抗性的转基因植物中转基因蛋白质的积累有一定的差异 .实验结果表明 ,表达PVYN CP基因的转基因烟草其抗病机制类似于转录后的基因沉默 ,即抗病性可能是RNA介导的 .图 7表 1参

基因芯片技术检测黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒和马铃薯Y病毒

黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒和马铃薯Y病毒是世界性分布的重要植物病毒,对农业生产危害较大。农作物感病多为复合侵染,症状表现较为复杂,急需建立快速、准确、能够一次检测多种病毒的检测方法。本研究根据3种病毒的外壳蛋白基因序列,设计引物和探针,制备基因芯片;用Cy3标记下游引物,RT-PCR扩增产物与芯片杂交,荧光扫描仪检测并分析信号。结果表明,该芯片可以从病毒侵染样本中检测到特异性识别信号,检测灵敏度比RT-PCR高10～100倍,该技术能对植物病毒做出快速、准确的检测。

马铃薯Y病毒CP基因5′端和3′端反向重复结构介导的抗病性研究

本研究克隆了来源于马铃薯Y病毒坏死株系(PVYN)外壳蛋白(CP)基因(PVYNCP)5′端和3′端的反向重复cDNA序列,并构建了植物表达载体pROKII-5′IR和pROKII-3′IR,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草NC89,分别获得166和126株转基因烟草。抗病性试验表明,转化PVYNCP基因3′端茎50 bp(环50 bp)hp RNA(hairpin RNA)的烟草抗病率达69%,而转化PVYNCP基因5′端相同片段长度的hpRNA的烟草却全部发病。Southern blot结果表明,转基因植株的抗病性与转基因的拷贝数之间无明显的相关性;Northern blot结果表明,目的片段转录产物的积累量与植株的抗病性呈负相关,证明所获得的抗病性是RNA介导的抗病性。研究结果证明PVYNCP基因的3′端比5′端更能有效地诱发基因沉默,并且hpRNA茎部的长度可减少到50 bp。该结果为探索利用CP基因的最短长度和有效部位的基因片段来培育多抗病毒转基因植物提供了依据。

改造的马铃薯Y病毒复制酶基因介导高度抗病性

提取马铃薯Y病毒中国分离株(PVY-C)的mRNA作为模板,随机六聚脱氧核苷酸和寡聚dT为引物合成了单链cDNA。通过聚合酶链式反应(PCR)获得了PVY-C的核内含体b(NIb)全长cDNA克隆。在对其进行全序列分析的基础上,构建了PVY-C NIb基因全长,5＇端缺失381个碱基和NIb反义RNA三种不同形式高等植物表达载体。在土壤农杆菌LBA4404的介导下,转化烟草生产品种NC89,获得了所有三种表达载体的转基因植株。通过分子生物学检测和抗性分析发现不同形式的NIb基因序列的转基因植株对马铃薯Y病毒表现不同程度的抗性。其中,以5＇端缺失的NIb的基因转化植株表现最好,从总共20个这类转化株系中筛选到4个株系至少在100μg/ml PVY-C接种浓度下,表现完全的抗病效果。从总共39个全长NIb基因转化株系中,仅有一个株系,在100μg/ml PVY-C的攻毒接种下具有完全的抗病性。所有33个NIb基因反义RNA的转化植株中,无一株系表现完全的抗病效果,但是有部分株系能不同程度地延缓或减轻发病程度,并有部分植株在发病后50d左右有恢复健康的趋势。虽然能够在上述3种形式的NIb基因序列的转基因植物中检测到相应的RNA的转录产物,但是均未能检测到其相应的蛋白表达产物。

马铃薯Y病毒CP基因RNAi载体构建与干涉效果测定

RNA沉默(RNAi)介导的植物抗病毒研究是近年来引起广泛关注的一项植物抗病毒基因工程策略。马铃薯Y病毒(PVY)在世界范围内引起马铃薯、烟草等重要经济作物的病害,并且造成严重的经济损失。本文以PVY的外壳蛋白(CP)基因为模板扩增300bp和354bp两个片段,正向和反向分别插入植物表达载体pROKⅡ的35S启动子下游,从而构建了以PVY的CP基因为靶标的RNAi植物表达载体pROKY300,转入农杆菌EHA105中,以农杆菌渗入法在本氏烟中瞬时表达与PVYCP同源的hairpin RNA。结果表明,瞬时表达的hairpinRNA有效干涉了PVY侵染。