停乳链球菌似马亚种致医院感染的临床特点与药物敏感性研究

目的探讨停乳链球菌似马亚种(SDSE)致医院感染的临床特点与药物敏感性,以提高临床医生对SDSE感染性疾病的认识,为抗感染治疗提供依据。方法回顾性分析2020年1月至2022年12月金华市第二医院临床科室分离出SDSE的49例患者临床资料,采用纸片扩散(K-B)法测定SDSE对19种抗菌药物的敏感性。结果SDSE感染患者主要为年龄≥60岁、存在有创操作史(或既往手术)、有放化疗史、应用广谱抗菌药物和(或)激素时间≥4周、存在严重基础疾病患者,主要临床表现为发热、畏寒、咳嗽、头痛等。SDSE菌株主要来源于痰液(46.94%)、血液(22.45%)和尿液(14.29%),主要分布于重症医学科(28.57%)、肿瘤内科(24.49%)、皮肤科(14.29%)、感染科(10.20%)。药敏试验未发现SDSE对万古霉素、利奈唑胺、奎奴普汀/达福普汀、呋喃妥因、头孢唑林、头孢曲松、头孢吡肟、青霉素G、阿莫西林、替加环素的耐药菌株,但对红霉素、克林霉素100.00%耐药。对庆大霉素、四环素、利福平、氯霉素、复方新诺明、左氧氟沙星、环丙沙星的耐药率均低于45.00%,且2020—2022年SDSE对以上7种受试药物的耐药率均呈明显上升趋势(均P<0.05)。SDSE感染患者选用头孢曲松、青霉素G、左氧氟沙星等抗菌药物治疗,均治愈或有好转。结论SDSE感染患者主要为免疫功能低下者,临床表现无特异性,对大多数抗菌药物敏感性较高,β-内酰胺类药物可作为治疗SDSE感染的首选药物。

豚鼠源马链球菌兽疫亚种的分离鉴定

为了查明河北省唐山市某豚鼠养殖场发病豚鼠感染的病原菌,本试验采集发病豚鼠的眼角脓性分泌物,采用细菌分离纯化、革兰染色、生化鉴定、16S rRNA基因PCR扩增方法对分离菌进行鉴定,通过K-B试纸法检测分离菌株对24种抗菌药的敏感性,试管二倍稀释法测定19种中药对该分离菌株的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),并通过动物回归试验检测该分离菌株的致病性。结果显示,分离菌株在血琼脂培养基培养24 h生长为针尖状透明菌落、呈β溶血,革兰染色为阳性圆球状、3~5个连接呈短链状,生化特性与马链球菌兽疫亚种相符,将其命名为MLQJ-1;16S rRNA序列比对结果显示,MLQJ-1与马链球菌兽疫亚种同源性高达99.72%,在系统进化树中处于同一分支,鉴定为马链球菌兽疫亚种;MLQJ-1对24种抗菌药的敏感性不同,对青霉素、头孢曲松和阿莫西林等8种抗菌药敏感,对阿米卡星、新霉素和卡那霉素等10种抗菌药耐药;苦地丁、苦参、黄芩和千里光对MLQJ-1的MIC值介于1.9~15.6 mg/mL,MBC值介于1.9~31.2 mg/mL;小鼠腹腔接种MLQJ-1菌液后24 h内全部死亡。结果表明,马链球菌兽疫亚种为本次发病豚鼠的病原菌,青霉素、头孢曲松和苦地丁等药物对该菌具有较强的抑菌效果。

马链球菌兽疫亚种表面蛋白FIPP的免疫效力评价

【目的】评价马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp. zooepidemicus,SEZ)表面蛋白FIPP(纤维蛋白原和Ig结合蛋白前体)的免疫效力,为预防SEZ感染提供新的候选疫苗抗原。【方法】根据NCBI数据库公布的FIPP基因序列设计引物进行PCR扩增,将扩增片段克隆到原核表达载体pColdⅠ,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,FIPP蛋白通过IPTG诱导在大肠杆菌中表达及纯化,以SDS-PAGE进行鉴定。纯化后的重组蛋白FIPP(rFIPP)对BALB/c小鼠进行免疫,二免14 d后对小鼠进行免疫保护试验并采集血清;解剖感染SEZ小鼠的肝脏、脾脏和肺脏进行病理组织学观察。以酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测小鼠血清中的特异性抗体IgG水平,以蛋白质印迹(Western blotting)方法检测重组蛋白的反应原性,通过全血杀菌试验检测血清的杀菌活性。【结果】通过SDS-PAGE电泳可观察到约96 k D的蛋白片段,与FIPP蛋白的理论分子量相符。重组蛋白rFIPP免疫小鼠后对SEZ攻击的保护率达70.0%。ELISA方法检测结果表明,重组蛋白rFIPP免疫小鼠后可诱导产生特异性抗体免疫球蛋白G(IgG),且极显著高于阴性对照(P<0.01,下同),通过IgG亚型分析,发现IgG1的抗体水平显著高于IgG2a(P<0.05),说明重组蛋白rFIPP免疫后产生的抗体亚型以IgG1为主。全血杀菌试验结果表明,重组蛋白rFIPP超免血清对SEZ具有极显著杀灭作用。组织病理学观察结果显示,重组蛋白rFIPP免疫后能有效减弱小鼠各类器官的病理损伤。【结论】经表达纯化的重组蛋白rFIPP在小鼠感染SEZ模型中具有良好的免疫保护效力,可用作制备SEZ亚单位疫苗的有效候选抗原。

马链球菌兽疫亚种重组表面蛋白rSeseC-02147免疫效力评价

【目的】通过原核表达系统制备马链球菌兽疫亚种(SEZ)重组表面蛋白rSeseC-02147,并系统评价其抵御SEZ感染的免疫效力,为SEZ亚单位疫苗的研发提供候选抗原。【方法】构建原核表达载体pCold I-SeseC-02147,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,纯化回收重组蛋白rSeseC-02147并免疫BALB/c小鼠,以SEZ灭活疫苗为阳性对照、PBS为阴性对照,二免后第14 d于小鼠颌下静脉采集血清,分别采用Western blotting和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测重组蛋白rSeseC-02147反应原性及小鼠血清抗体效价和抗体亚型属性;并通过小鼠免疫保护试验、腹腔灌洗液细菌载量测定及脏器组织病理学观察,系统评估重组蛋白rSeseC-02147对小鼠的免疫保护力。【结果】构建的原核表达载体pCold I-SeseC-02147经IPTG诱导能成功表达获得重组蛋白rSeseC-02147,其纯化后的浓度为2.86 mg/mL。重组蛋白rSeseC-02147能与免疫组和阳性对照组小鼠血清发生特异性反应,而与阴性对照组小鼠血清未发生特异性反应,表明重组蛋白rSeseC-02147具有良好的反应原性与特异性;以重组蛋白rSeseC-02147免疫小鼠产生的血清抗体效价远高于SEZ灭活疫苗,且IgG1亚型极显著高于IgG2a亚型(P<0.01,下同)。重组蛋白rSeseC-02147可为小鼠提供抵御SEZ感染的免疫保护力,攻毒后14 d内的存活率60%;此外,重组蛋白rSeseC-02147免疫小鼠后的腹腔灌洗液细菌载量极显著低于阴性对照组小鼠,且肺脏、肾脏和脾脏等组织的病理损伤程度较轻。【结论】通过原核表达系统制备获得的重组蛋白rSeseC-02147具有良好的特异性与反应原性,通过抑制SEZ增殖及减轻SEZ对机体脏器的损伤而发挥免疫保护作用。可见,重组蛋白rSeseC-02147具有开发成SEZ亚单位疫苗的潜力。

马链球菌马亚种FNEB蛋白的截短表达及其免疫保护性研究

为研究马链球菌马亚种FNEB蛋白的免疫保护性,本研究采用PCR方法从马链球菌马亚种新疆分离株中扩增FNEB基因部分片段,克隆于原核表达载体p ET-30a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,以IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和western blot分析显示,重组蛋白大小约60 ku,具有良好的抗原性。将纯化的重组蛋白免疫小鼠后,以马链球菌马亚种新疆分离株进行攻毒,结果显示该重组蛋白对免疫组小鼠具有保护力,保护率为65%。本研究克隆了马链球菌马亚种的FNEB截短基因并表达了相应重组蛋白,免疫小鼠后能够提供较好的保护,为重组FNEB蛋白亚单位疫苗的研制奠定基础。

马链球菌兽疫亚种类M蛋白的基因克隆、序列分析及其在猪源链球菌的检测

根据已发表的马链球菌兽疫亚种 (Streptococcusequisubsp .zooepidemicus)马源株的类M蛋白基因序列 ,设计和合成一对引物 ,以兽疫亚种猪源ATCC35 2 4 6株的基因组DNA为模板 ,通过PCR技术 ,扩增出类M蛋白基因并定向克隆至表达载体pET_32a(+)中 ,测定其序列 ,GenBank接收号为AY2 6 3781。类M蛋白基因含一个完整的开放阅读框 ,全长为 1137bp ,编码 379个氨基酸残基。经DNAStar软件分析 ,ATCC35 2 4 6株类M蛋白基因与兽疫亚种马源W6 0株、马亚种的类M蛋白基因及A群化脓链球菌的M蛋白基因的同源性分别为 86 9%、30 8%、2 9 4 % ;推导的氨基酸序列的同源性分别为 84 3%、2 1 9%、2 3 4 %。但ATCC35 2 4 6株类M蛋白的C末端细胞膜锚定区与M蛋白、马亚种类M蛋白高度同源。用上述设计的引物进行PCR试验 ,检测 34株猪源链球菌类M蛋白基因 ,发现所有 16株C群猪源链球菌均能检测出类M蛋白基因 ,而所有猪链球菌 (Streptococcussuis) 1型和 2型菌株及S群、B群、D群链球菌共 13株均不能检出类M蛋白基因 ,而 5株未鉴定的猪源链球菌中 3株能检测出类M基因。

马链球菌兽疫亚种类M基因和猪链球菌2型mrp基因片段的融合表达及仔猪免疫试验

将含猪链球菌 2型mrp及马链球菌兽疫亚种类M基因融合片段的重组质粒转化大肠杆菌BL 2 1,经异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,表达了相对分子质量为 6 0 0 0 0左右的融合蛋白。利用组氨酸亲和层析柱 ,获得了纯化的融合蛋白 ,质量浓度为 4 2 μg·mL-1。以纯化的融合蛋白、宿主菌BL 2 1经IPTG诱导表达后的超声波破碎上清、马链球菌兽疫亚种ATCC 35 2 4 6株和猪链球菌 2型HA 980 1株制备的二联灭活苗为免疫原 ,分别免疫 30头仔猪。初次免疫 1月后 ,以同样的剂量再次免疫 ,3周后以 5×LD50 的ATCC 35 2 4 6和HA 980 1强毒株进行攻击。结果 ,纯化融合蛋白免疫组的免疫保护率达 6 0 % ,BL 2 1上清免疫组的免疫保护率为 5 0 % ,全菌二联灭活菌苗的免疫保护率达 90 %。

快速鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种双重PCR方法的建立

本试验旨在建立一种快速、特异、敏感的双重PCR鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种病原检测方法。根据猪链球菌GDH蛋白和马链球菌类M蛋白的基因保守区分别设计引物,优化了该双重PCR检测方法的引物浓度及比例,并筛选了其最佳退火温度;用该双重PCR反应体系以其他几株阴性菌株为对照,检测了该反应体系的特异性。以新鲜培养的猪链球菌倍比稀释后进行菌落计数,对该检测方法的敏感性进行了鉴定。M-like和GDH引物的加入量均为1μL(20pmol/L),最佳退火温度为52.3℃;该双重PCR反应体系有较高敏感性,检测马链球菌兽疫亚种和猪链球菌的敏感度分别达100和10CFU;特异性试验结果显示,常见的5种病原菌在该双重PCR体系中无特异性条带出现;临床应用该方法分离鉴定了1株猪链球菌和2株马链球菌兽疫亚种。本试验建立了一种能同时检测猪链球菌和马链球菌兽疫亚种的双重PCR方法,且该方法应用快速、特异且敏感。

马链球菌马亚种新疆株SeM基因的克隆及序列差异分析

为研究马链球菌马亚种新疆株SeM基因的分子特征,分析新疆地区马链球菌马亚种的分子流行特征以及为马腺疫的防治提供依据,对分离并鉴定的5株马链球菌马亚种提取基因组、扩增并克隆其SeM基因（GenBank登录号分别为：KJ486792、KJ486793、KJ486794、KJ486795、KJ486796）,采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行疏水性、抗原性及三级结构分析,并与Genbank登录菌株的SeM基因序列进行系统进化分析和比较。克隆获得的SeM基因长度为1 530bp,包含1个1 527bp的完整开放阅读框,编码509个氨基酸;新疆分离株SeM基因与Genbank登录分离株SeM基因同源性为98.0%~99.4%。结果表明,新疆分离株KJ486793、KJ486796与美国分离株亲缘关系较近,属同一个进化分支,另外3株新疆分离株KJ486792、KJ486795、KJ486794构成一个独立分支。

停乳链球菌似马亚种血流感染12例

目的通过分析停乳链球菌似马亚种血流感染的临床特征,提高对停乳链球菌似马亚种血流感染的认识。方法回顾性分析广西医科大学第四附属医院2012年1月-2017年8月经血培养确诊的停乳链球菌似马亚种血流感染患者12例的一般资料、基础疾病、临床表现、实验室检查、治疗及转归。结果 12例停乳链球菌似马亚种血流感染患者中11例(91.7%)有基础疾病,以恶性肿瘤(6例,50.0%)、高血压病(4例,33.3%)和冠心病(3例,25.0%)常见;11例(91.7%)存在既往手术(或有创操作)史;主要临床表现为发热(12例,100%)、畏寒(6例,50.0%)、咳嗽(5例,41.7%)和腹痛(3例,25.0%)。发热以急性高热为主,最高体温38.7~40.2℃,发病时间0~96 h,9例(75.0%)合并有淋巴管炎;体外药敏试验显示:停乳链球菌似马亚种对青霉素、头孢噻肟、左氧氟沙星、万古霉素和喹奴普丁的敏感率达100%,对四环素、克林霉素和红霉素的敏感率为33.3%、33.3%和25.0%。12例(100%)患者给予青霉素类、头孢菌素类和氟喹诺酮类等抗菌药物治疗后均好转或治愈。结论停乳链球菌似马亚种血流感染患者多有基础疾病和手术(或有创操作)史,以急性高热为主要表现,易引起淋巴管炎,治疗上首选青霉素抗感染治疗。

马链球菌兽疫亚种类M蛋白亚单位疫苗小鼠免疫试验

为获得控制猪链球菌病安全高效的疫苗,本试验进行了马链球菌兽疫亚种类M蛋白亚单位疫苗的研制。应用热酸法提取马链球菌兽疫亚种ATCC35246株类M蛋白,并分别采用羟基磷灰石(HAT)层析和冷酒精沉淀法进行纯化,结果得到较纯的类M蛋白。用热酸提取的粗制类M蛋白、2种纯化的类M蛋白及全菌苗免疫小鼠,结果保护率分别为92%(11/12)、100%(12/12)、100%(12/12)和83%(10/12),表明类M蛋白亚单位疫苗有进一步开发的必要。

猪链球菌2型与马链球菌兽疫亚种生物学特性的初步比较

1998年从病死猪分离了数株链球菌 ,其中 2株编号为 980 1,980 2。经鉴定 ,980 1株为猪链球菌 2型 ,980 2株为马链球菌兽疫亚种。 980 1株系从暴发流行地区的病猪中分离 ,同时在该流行地区还发生畜禽从业人员感染相同血清型的链球菌而死亡的病例 ;980 2株系从散发病猪中分离。临床有共同点 ,又有各自特点。病理变化均呈现典型的败血症变化 ,但肝、脾、肺等病变上有一些差别 ,而染色镜检基本一致。对兔均敏感 ,对小白鼠和猪的敏感性有所不同。 980 1株菌落灰色 ,中心浑浊 ,直径 0 5mm ,α溶血 ,有草绿色色素沉着 ;980 2株菌落湿润 ,半透明 ,直径 1 5～ 2mm ,β溶血。 980 1株对氧哌嗪青霉素、头孢他啶、氨苄青霉素最敏感 ;980 2株对氧哌嗪青霉素、复方磺胺、头孢哌酮。

马链球菌马亚种新疆分离株XZ1SeM蛋白表达和免疫原性分析

为研究马链球菌马亚种新疆分离株XZ1SeM重组蛋白的免疫生物学功能,评价其作为抗原开展研制马链球菌疫苗的价值。采用PCR方法从马链球菌马亚种扩增其SeM基因,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,诱导表达并用纯化的重组蛋白作免疫原免疫小鼠,分析比较重组蛋白免疫后小鼠抗体水平及对小鼠的免疫保护力。结果表明,纯化得到64ku的SeM重组蛋白,且该蛋白可与马链球菌马亚种阳性血清发生特异性反应。间接ELISA检测的抗体效价高达1∶128 000,具有良好的免疫原性,免疫小鼠攻毒结果显示重组蛋白免疫对小鼠有良好的保护效果。

马源马链球菌兽疫亚种新疆株的分离鉴定及遗传特性分析

为了解马源马链球菌兽疫亚种(S.zooepidemicus)新疆分离株马链球菌兽疫亚种类M蛋白(SzM)基因的分子进化与变异情况,为该菌引起的感染性疾病的防控提供依据,本试验对新疆地区某马场采集的病马淋巴结样品进行病原菌的分离培养和生化鉴定,并对分离菌株进行药物敏感性试验。根据已发表的马源SzM基因序列设计引物,对其SzM基因进行PCR扩增及序列测定。将获得的SzM序列与GenBank中不同动物源马链球菌兽疫亚种分离株序列进行同源性比对和遗传进化分析。结果显示,分离得到了一株革兰氏阳性链球菌,将其命名为马链球菌兽疫亚种ZMSY15-1。药物敏感性试验结果表明,分离菌株对青霉素、磺胺嘧啶钠耐药,对其他14种药物均敏感。序列分析结果显示,马链球菌兽疫亚种ZMSY15-1与国内外不同动物源分离株SzM基因氨基酸同源性为56.0%～70.0%。遗传进化分析结果显示,这些菌株可分为4个群。马链球菌兽疫亚种ZMSY15-1与猪源分离株SzM蛋白的氨基酸同源性为59.9%,分别属于2个不同的群,其与美国马源分离株NH55426亲缘关系最近。本试验结果可丰富国内马源马链球菌兽疫亚种SzM基因的信息数据,为马链球菌兽疫亚种的致病机制研究和预防控制提供参考依据。

猪源马链球菌兽疫亚种中国分离株类M基因特性分析

目的阐明国内不同区域猪源马链球菌兽疫亚种分离株类M基因的特性,为疫苗研制提供指导。方法利用PCR技术,扩增国内9省市从1974～2003年分离的9株马链球菌兽疫亚种类M基因,并进行克隆、测序及序列分析。结果发现7株类M基因长度为1137bp,含一个阅读框,CG-74-63和CP-0104株的长度分别为1143bp及1125bp。除1株关节炎分离株CP-0104外,引致败血症的8株菌类M基因的核苷酸同源性高达95.4%～99.9%,推导的相应氨基酸序列同源性高达92.1%～100%。9株猪源菌与马源菌株及人源菌株类M基因的核苷酸同源性分别为81.6%～87.0%、81.7%～91.8%。9株猪源分离株类M蛋白信号肽、C末端细胞锚定区的序列均高度同源;除CP-0104外,其余8株高变区高度同源。结论国内不同区域猪源马链球菌兽疫亚种分离株类M基因同源性高。

马链球菌兽疫亚种10株国内猪源分离株对小鼠免疫效力的评价

目的近年来马链球菌兽疫亚种引起的猪链球菌病在我国造成重大损失。为评价猪源兽疫亚种分离株的抗原变异,取国内10省市分离的10株猪源兽疫亚种分离株,分别制备灭活抗原,加入弗氏完全佐剂免疫12 w龄ICR小鼠,4 w后加入弗氏不完全佐剂进行再次免疫,再次免疫2 w后分别用5 LD50同源菌株和1.6×105CFU ATCC35246株攻击。结果表明,同源菌株攻击,免疫保护率均在90%以上;而以ATCC35246攻击的异源菌免疫小鼠,免疫保护率为80%-100%。可见我国不同地区的猪源马链球菌兽疫亚种分离株的抗原性差异不大,单一菌株制备的疫苗具有应用前景。

猪源马链球菌兽疫亚种灭活疫苗对小鼠的免疫效力评价

【目的】评价中国不同地区猪源马链球菌兽疫亚种分离株抗原性的差异,为猪链球菌病疫苗的研制提供指导。【方法】取从国内10省市分离的10株猪源马链球菌兽疫亚种分离株,分别制备灭活疫苗,免疫12周龄ICR小鼠,用同源菌株和ATCC35246株攻击。【结果】以同源菌株攻击免疫小鼠,除CG-74-63株外,其余菌株的保护率均在90%以上;而以异源菌株ATCC35246进行攻击,免疫小鼠的免疫保护率为80%～100%。【结论】中国不同地区的猪源马链球菌兽疫亚种分离株的抗原性差异不大,单一菌株制备的疫苗具有保护性。

猪源马链球菌兽疫亚种类 M蛋白原核表达及其小鼠免疫保护力分析

为了原核表达猪源马链球菌兽疫亚种去除信号肽的类M蛋白质,并分析该蛋白质对小鼠的免疫保护力,克隆了马链球菌兽疫亚种CY菌株去除信号肽的类M蛋白质基因Szp,并将Szp基因插入p ET28a表达载体,IPTG诱导,获得重组类M蛋白质,弗氏佐剂乳化重组类M蛋白质后,3次免疫小鼠,用同源菌株CY攻击。诱导获得分子量约5.8×104的重组蛋白质,免疫印迹结果表明该重组类M蛋白质能够被马链球菌兽疫亚种猪多抗识别。类M蛋白质免疫小鼠的存活率为60%,弗氏佐剂乳化灭活CY免疫小鼠的存活率为70%,PBS对照组小鼠攻毒后6 d内全部死亡。表达的类M蛋白质可以给予ICR小鼠部分的免疫保护力,保护效果略低于CY全菌灭活苗,提示可以对马链球菌兽疫亚种多种免疫保护性抗原进行联合,从而进一步提高对动物的免疫保护力。