基于行业标准中马和驴成分检测方法用于骡肉检测的分析

应用基于线粒体基因的行业标准检测方法SN/T 3730.4—2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第4部分:驴成分检测实时荧光PCR法》和SN/T 3730.5—2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第5部分:马成分检测实时荧光PCR法》检测骡肉时,存在马、驴成分均可检出的情况,与线粒体严格母系遗传的理论相左。因此,本研究通过测序法和行业标准中的马、驴成分检测方法对骡肉进行检测,对SN/T 3730.4—2013用于骡肉检测的结果进行分析和讨论。本研究基于线粒体基因和核基因聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)测序、SN/T 3730.4—2013、SN/T 3730.5—2013方法对9份单一肉块样品进行了检测。结合线粒体基因和核基因的检测结果,确定3份骡肉均为马骡肉;采用SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013方法对3份马骡肉均能检出驴成分和马成分,SN/T 3730.5—2013对马骡肉中马成分检测的循环阈值(cycle threshold,Ct)≤20.00;SN/T3730.4—2013对马骡肉中驴成分检测的Ct值在25.00~35.00范围内,且以SN/T 3730.4—2013中引物进行的普通PCR产物测序结果显示,3份骡肉与马、驴均不同源。分析认为,出现该现象的原因可能是SN/T 3730.4—2013靶序列以核内线粒体DNA片段形式和较低的重复数出现在马骡核基因组中,并且发生了部分碱基的插入、缺失。采用行业标准SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013对已知来源于单一动物源性成分的样品进行马、驴成分检测时,当马成分检测的Ct值≤20.00,同时驴成分检测的Ct值在25.00~35.00范围内时,应考虑马骡成分存在的可能性。

探讨《驴成分检测实时荧光PCR法》标准中检出限的合理性

目的探讨SN/T3730.4-2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第四部分:驴成分检测实时荧光PCR法》标准中检出限规定的合理性。方法参考SN/T 3730.4-2013提供的引物及探针序列,采用实时荧光PCR检测方法鉴别市场抽检驴肉的真伪性。结果 Ct值在25~35之间的样品按照SN/T 3730.4-2013标准规定应判为检出驴成分,但通过对上述样品用马源性引物进行扩增和测序得知样品为马肉而非驴肉。结论建议标准应根据不同的检验对象制定不同的检出限,从而降低出现假阳性的概率。

基于核质遗传原理建立多重PCR检测方法鉴定阿胶中马、驴源性成分及皮张种源

阿胶(Asini Colla Corii)及其原料皮张源性成分的鉴定是对阿胶真实性的一种保障,阿胶生产企业和市场监管部门急需马、驴、骡皮张以及阿胶中源性成分鉴别的有效检测方法。本研究基于马、驴核基因组和线粒体基因组筛选物种特异性DNA序列作为检测靶标,设计马、驴特异性引物,建立了鉴别马、驴、骡皮张以及鉴定阿胶中马和驴源性成分的多重PCR方法。结果显示,本文所建立的方法可用于阿胶源性成分及皮张种源的鉴别,其特异性强,只在目标物种中扩增出目的条带,而非目标物种中没有任何扩增产物,而且灵敏度能达到0.2 ng,可为阿胶生产企业和市场监管部门提供技术支撑。

基于TaqMan实时荧光PCR检测鲜肉及加工肉制品中的驴源性成分

根据出入境检验检疫行业标准SN/T 3730.4—2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法?第4部分:驴成分检测?实时荧光PCR法》合成引物和探针,利用Taq Man实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测鲜肉及加工肉制品中的驴源性成分。首先对13种不同动物鲜肉组织的DNA进行驴源性成分特异性检测,然后对驴源性DNA模板原液进行梯度稀释,检测方法灵敏度,最后在加工肉制品中检测方法的适用性。结果表明:本研究建立的方法特异性强,除驴肉外,牛、羊、猪、马、骆驼、鹿、狗、兔、鸡、鸭、鸽子、鹌鹑12种动物鲜肉组织均无特异性扩增;方法的灵敏度较高,驴组分DNA的检出限可达100 fg/μL,灵敏度可达0.01%;方法的适用性较广,可以用于加工肉制品中驴源性成分的检测。

基于液质联用法同时检测龟甲胶饮片中牛皮源、驴皮源及龟甲胶成分

目的:建立龟甲胶饮片中牛皮源、驴皮源及龟甲胶成分同时检测方法。方法:采用胰蛋白酶对龟甲胶样品酶解处理,利用超高效液相色谱-串联质谱联用技术(UPLC-MS/MS)对样品中龟甲胶、黄明胶、阿胶的特征肽离子对进行检测。结果:龟甲胶、黄明胶、阿胶3种对照药材在所建方法下保留时间为3~8 min,无基质干扰,检测限分别为0.5,2.0,1.0 mg/L,且重复性好,用于18批市售龟甲胶饮片的检测分析。结论:所建方法专属性强、灵敏度高,实现了龟甲胶饮片中主成分鉴别与非法添加成分检查的同时检测,提高检验效率,可有效控制龟甲胶质量。

超高效液相色谱-串联四极杆质谱法同时检测鹿角胶饮片中牛皮源、驴皮源及鹿角胶成分

目的建立鹿角胶饮片中牛皮源、驴皮源及鹿角胶成分同时检测方法。方法精密称定鹿角胶饮片粉末0.1 g,加1%碳酸氢铵溶液超声溶解、稀释、过滤,用胰蛋白酶酶解12小时,利用超高效液相色谱-串联质谱联用技术(UPLC-MS/MS)和多反应监测模式(MRM)分别检测黄明胶特征肽段离子对(m/z)641.3→726.2,783.3,阿胶特征肽段离子对(m/z)539.8→612.4,924.0,鹿角胶特征肽段离子对(m/z)765.4→554.0,733.0。色谱柱为BEH-C18,以乙腈—0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱。分别考察上述三种特征肽段离子对的专属性,并用逐级稀释法确定方法检出限。用所建方法检测10批市售鹿角胶饮片。结果黄明胶、阿胶、鹿角胶三种对照药材在所建方法下保留时间分别为3.6分钟、6.2分钟和10.9分钟,无基质干扰,检测限分别为0.1,2.0,1.0 mg/L,对照药材混合溶液进样6次,鹿角胶峰面积RSD为2.1%,黄明胶峰面积RSD为3.7%,阿胶峰面积RSD为2.8%,方法重复性良好。将所建方法应用于10批市售鹿角胶饮片的检测分析,1批结果为不合格(检出牛皮源成分)。结论所建方法专属性强、灵敏度高,实现了鹿角胶饮片中主成分鉴别与非法添加成分检查的同时检测,进一步提高检验效率,可有效控制鹿角胶质量。

饲料中马、驴源性成分的分子生物学检测技术

根据马、驴线粒体DNA中的保守区段设计了一对引物,通过聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)可以专一地检测扩增出马、驴源性成分的DNA片段,再经限制性内切酶Sau3A和AluⅠ的酶切鉴定可以区分马源性成分和驴源性成分,PCR扩增产物的测序结果验证了酶切鉴定结果的正确性。引物灵敏度测试结果表明该方法的检测低限均达0.3%,该对引物可以成为检测马、驴源性成分高效准确的检测工具。

肉制品中驴源性成分PCR方法的建立及应用

建立了驴源性成分的快速分子检测方法,确立了1对驴源性成分的特异性引物HorseF/HorseR,扩增目的片段的长度是294 bp,经验证引物对驴源性成分的特异性良好,确立了PCR反应的最佳反应体系和最优反应条件。反应体系的检测灵敏度是13.7 pg/μL。扩增片段经AluⅠ酶切分析确认,所得181、113 bp片段与分析结果一致。利用该方法对市售样品进行检测,检测结果准确。

食品中驴源性成分环介导等温扩增检测方法的建立

建立食品中驴源性成分环介导等温扩增检测方法,对市售食品进行驴源性成分检测分析。针对驴的线粒体ATPase 6基因设计特异性引物,优化LAMP反应条件,验证引物的特异性和检出限。在DNA模板1.0μL,内引物FIP/BIP各1.6μL,外引物F3/B3各0.2μL, dNTPs 2.5μL, Mg2+4μL, Bst DNA聚合酶缓冲液添加量2.0μL, Bst DNA聚合酶2.0μL体系下, LAMP法对食品中驴源性成分检测荧光可视法检测限为0.01%。LAMP方法检测食品中驴源性成分是切实可行的。与其他扩增技术相比,该方法具有操作简单、成本低、灵敏、快速的优势,适合于在基层单位进行推广应用。

饲料中马、驴源性成分的分子生物学检测技术

本研究根据马、驴线粒体 DNA 中的保守区段设计了一对引物,通过聚合酶链式反应(polymerase chainreaction,PCR)采取马、驴、牛、羊、猪、鸡、兔、鹿、火鸡等实验材料进行扩增,可以专一地扩增出马、驴源性成分的 DNA 片段,再经限制性内切酶 Sau 3A 和 Alu Ⅰ的酶切鉴定可以区分马源性成分和驴源性成分,PCR扩增产物的测序结果验证了酶切鉴定结果的正确性。引物灵敏度测试结果表明该方法的检测低限均达0.3%,该对引物可以成为检测马、驴源性成分高效准确的检测工具。

阿胶原料驴源性成分的DNA分子鉴别方法

目的:建立阿胶原料驴源性成分的鉴别方法。方法:通过聚合酶链式反应(PCR),扩增基因组上的线粒体细胞色素b(Cytb)基因,继而用限制性内切酶Bam HⅠ对该聚合酶链式反应产物进行酶切,将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳及紫外成像。结果:驴源性成分Cytb的PCR产物能够被Bam HⅠ酶切成76 bp和314 bp 2个片段,而马源性成分均不能够被酶切。结论:结合聚合酶链式反应与限制性内切酶片段长度多态性法(PCR-RFLP),可以鉴别阿胶原料驴源性成分。

基于微滴数字PCR阿胶定量检测方法的建立

为对阿胶及相关产品进行精确定量和纯度鉴定,本研究建立了一种基于微滴数字PCR(dd PCR)的阿胶定量检测方法。结果显示,在一定范围内阿胶质量与DNA含量以及DNA含量与DNA绝对拷贝数间均呈线性关系。以DNA含量作为换算值,确定出阿胶质量M阿胶(mg)与DNA绝对拷贝数C(copies/μL)的线性关系为M阿胶=0.13C+3.05。最终利用dd PCR检测样品中目的基因的绝对拷贝数来确定样品中的阿胶含量。准确性验证实验显示实测值与真实值基本保持一致,实测偏差最大仅为4.0%,这表明所建立的方法准确可靠。利用该方法对市场上不同品牌的8个阿胶和2个阿胶速溶粉进行检测,结果显示8个阿胶中,3款阿胶较纯,2款阿胶的阿胶含量较低,最低的仅为23.3%。而2款阿胶速溶粉的阿胶含量分别为44.8%和39.8%。以上表明该方法能有效对市售的阿胶产品进行定量检测和纯度鉴定。本实验建立的基于dd PCR的阿胶定量检测方法准确、高效、稳定,有较大的应用价值和应用前景,可有效预防阿胶掺假现象的发生。