中国咖啡主栽区咖啡种质资源圃中咖啡驼孢锈菌致病类型鉴定和分析

【目的】研究中国咖啡主栽区咖啡种质资源圃中由专性寄生病原真菌咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix Berk.et Br.)引起的咖啡黄锈病(coffee leaf rust,CLR)致病类型,对保护中国咖啡种质资源以及指导主栽区抗性品种的布局和选育具有重要意义。【方法】收集分布在中国咖啡主栽区4个具有代表性的咖啡种质资源圃CLR病样,在超感病基因型寄主上进行扩繁及单孢分离,在特定基因型寄主上对咖啡驼孢锈菌的毒力基因进行鉴定,并推导出相应的致病类型。【结果】57份样品中,有42份样品(占73.68%)被成功扩繁,有27份样品(占64.29%)被保存。根据样品信息录入23个CIFC条目,共鉴定出3种致病类型:XXXⅦ(v_(2,5,6,7,9)),占86.96%,为优势致病类型;New race(v_(2,5,6,7)),占8.69%,为在中国种质资源圃CLR调查的首次报道;XXXIV(v_(2,5,7,9)),占4.35%。【结论】中国咖啡主栽区咖啡驼孢锈菌群体遗传结构正在发生改变,原有致病类型已渗入位于主栽区内的种质资源圃,并在基因型相近的寄主上加速进化;新的致病类型在主栽区内的咖啡基地和种质资源圃之间随机流动,并对当前主栽品种的抗性造成威胁。研究结果将为中国咖啡种质资源圃的科学管理提供重要依据,为CLR防控提供理论支持。

咖啡驼孢锈菌ITS序列特征及系统发育关系

为了了解咖啡驼孢锈菌ITS序列特征及系统发育关系,本研究对来自中国咖啡栽培区的咖啡驼孢锈菌ITS序列进行了克隆。将克隆序列与来自不同咖啡种植区的咖啡驼孢锈菌菌株序列多样性进行了比较,并于NCBI数据库中下载其他锈菌菌株ITS序列进行系统发育关系研究。结果表明,来自中国咖啡栽培区的咖啡驼孢锈菌ITS序列全长950 bp。其中ITS1长为224 bp,GC含量介于30.36%～31.25%之间;5.8S长为153 bp, GC含量为37.25%;ITS2长483～485 bp,GC含量介于24.12%～25.05%。来自不同咖啡种植区咖啡驼孢锈菌ITS核苷酸序列多态性虽然存在一定差异,但是其多样性十分低且不存在明显的区域分化。在系统发育关系方面,咖啡驼孢锈菌与其他锈菌ITS序列差异明显,能独立聚类成一个分支。

咖啡驼孢锈菌PCR分子检测体系的建立

由专性寄生菌咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)引起的咖啡叶锈病是影响咖啡产量的最主要真菌病害。为建立对咖啡驼孢锈菌具有高特异性、高灵敏度、易操作的分子检测方法,本研究通过对咖啡驼孢锈菌DNA核糖体转录间隔区ITS1~ITS4序列与其近源序列作多重比较分析,获得其特异性区域,并于特异性区域设计了1对引物Hv-ITS-F/R。利用该特异引物,通过对咖啡驼孢锈菌、咖啡褐斑病菌、咖啡锈菌重寄生菌、咖啡炭疽菌以及不同属其它真菌基因组DNA进行PCR扩增。结果表明:此引物对仅能从咖啡驼孢锈菌基因组DNA中扩增出396 bp的特异条带,对其它相似或相近的病原真菌则无扩增条带。灵敏度试验结果表明,在DNA水平上检测浓度可达10 pg/μL。进一步通过田间健康与疑似发病植株的检测,结果呈现出很好的应用前景。由此表明,该引物对能有效地用于咖啡组织中驼孢锈菌的检测。

咖啡叶锈病菌单管巢式PCR检测体系的建立与应用

由专性寄生菌咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)引起的咖啡叶锈病是小粒种咖啡生产中的一种毁灭性病害,建立高效、准确的分子检测技术对于该病害的快速鉴定与监测具有重要意义。本研究基于咖啡叶锈病菌ITS序列保守区域设计该病原菌的单管巢式引物对,通过单因素试验筛选外引物与内引物退火温度后,进一步对单管巢式PCR检测反应体系的内、外引物浓度、dNTPs浓度、以及rTaq酶用量等4个关键因素进行正交优化试验,从而建立高效的单管巢式PCR检测反应体系。结果表明,咖啡叶锈病菌单管巢式PCR外引物HvF1/HvR1、内引物HvF2/HvR2的最佳退火温度分别为63℃与52℃。正交试验显示,在20μL的反应体系中各组分的最佳含量分别为:10×rTaq Buffer 2.5μL,2.5 mmol/L dNTPs 3.2μL,rTaq DNA Polymerase(5 U/μL)1.8μL,7μmol/L的HvF2/HvR2各1μL,1nmol/L的HvF1/HvR1各1μL,模板DNA1μL,ddH207.5μL。所建立的单管巢式PCR检测体系具有高度特异性,能从含有咖啡叶锈病菌DNA模板中检测出特异性条带,而其他供试的非咖啡叶锈病菌DNA模板中扩增不出任何条带。该检测技术体系的最低检测限为5 fg/μL,是普通PCR灵敏度的100倍。采集的22份早期疑似病样经检测鉴定均含有咖啡驼孢锈菌。本试验建立的单管巢式检测技术可用于咖啡叶锈病菌的快速鉴定,可用于病害监测预警。

咖啡锈病的防治

防治咖啡锈病的方法,包括化学防治、农业防治和生物防治等,不同的方法各具一定的优势和局限性。近年来,随着基因工程的出现和发展,出现了一系列新的育种技术,保证了咖啡锈病的有效防治。本文主要对咖啡锈病防治的发展、面临的挑战和前景进行综述。