驽巴贝虫病间接ELISA检测方法的建立

目的克隆表达驽巴贝虫诊断抗原基因BC48,建立间接ELISA诊断方法。方法从感染驽巴贝虫的毛驴血液中提取虫体基因组DNA,利用PCR技术扩增BC48基因,将其克隆入表达载体pET-28a,转化大肠埃希菌感受态细胞,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,用镍柱亲和层析法纯化蛋白。以该蛋白作为诊断抗原建立间接ELISA诊断方法 ,对反应条件进行优化,并对该方法的特异性和敏感性进行评价。结果扩增获得1272bp的BC48基因片段。重组表达质粒pET-28a-BC48诱导后获得大小约为Mr46000的可溶性融合蛋白,纯化后蛋白浓度为12.98mg/ml。间接ELISA方法条件优化的结果显示,最佳抗原包被浓度为65μg/ml,最适血清稀释度为1∶80,该融合蛋白可特异性地与驽巴贝虫感染血清结合,而不与马泰勒虫感染血清及阴性血清反应。使用该方法与镜检法检测17份散养毛驴血清样品,阳性检出率分别为3/17和2/17。结论以BC48重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法可用于马属动物驽巴贝虫病的检测。

驽巴贝虫BC-48基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用PCR方法扩增驽巴贝虫吉林分离株BC-48基因片段,将扩增产物与pGEM-T Easy载体连接,重组质粒经PCR、单酶切鉴定后测序;构建BC-48的重组pGEX-4T-2表达载体,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western-blotting分析。结果显示,克隆的BC-48基因片段长610 bp,含有一个570 bp的开放阅读框,编码189个氨基酸,与GenBank中USDA株(U46551)的同源性为96.7%;表达的融合蛋白为45 ku,能被驽巴贝虫阳性血清识别;表明该融合蛋白具有较好的反应原性。

驽巴贝虫和马泰勒虫双重PCR检测方法的建立

目的建立驽巴贝虫(Babesia caballi)和马泰勒虫(Theileria equi)的双重PCR检测方法。方法根据Gen Bank发表的驽巴贝虫裂殖子m RNA BC48基因保守序列和马泰勒虫核糖体小亚基18 s r RNA基因保守序列,设计、合成2对特异性引物,经优化反应条件,建立双重PCR检测方法,并检测该方法的特异性和敏感性。用该双重PCR法对采集于伊犁地区马疑似病例全血样品进行检测,并与镜检法、常规PCR和荧光PCR的结果进行比较。结果建立的双重PCR法可特异性地扩增驽巴贝虫和马泰勒虫的相应目的条带,分别长约155 bp和280 bp,而对其他种属的双芽巴贝虫(B.bigemina)、环形泰勒虫(T.annulata)、瑟氏泰勒虫(T.sergenti)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、犬新孢子虫(Neospora caninum)和伊氏锥虫(Trypanosoma evansi)进行扩增未见相应片段。该方法对驽巴贝虫和马泰勒虫的最低检出浓度分别为4.85×105拷贝/μl和4.85×104拷贝/μl。对采集的24份疑似血样进行双重PCR扩增,驽巴贝虫的阳性率为45.8%(11/24),马泰勒虫的阳性率为75.0%(18/24),镜检法、常规PCR和荧光PCR与双重PCR检测的符合率分别为91.7%(22/24)、95.8%(23/24)和95.8%(23/24)。结论建立了可同时检测驽巴贝虫和马泰勒虫的双重PCR方法。

咪唑苯脲缓释剂研制及其在驽巴贝虫病流行区的应用

驽巴贝虫病已有多种药物可以治疗，有些疗效甚佳，但用于预防本病的制剂却很少。在生产实践中，治疗只是一种挽救损失的被动措施，而不能主动有效地控制发病。我们在对陇东南地区驽巴贝虫病的防治中同样发现这个问题，驽巴贝虫病显示症状后才被发现，而且多为疾病后期，病...

陇东南地区马驽巴贝虫病传播媒介蜱的调查

陇东南地区马驽巴贝虫病传播媒介蜱的调查宋建国李跃增卢旺银（甘肃省兽医技术推广总站兰州７３００４６）杨明魁王举钧（礼县畜牧技术服务中心甘肃省陇东南地区马属家畜中间断流行着以高热、贫血、黄疸为特征的驽巴贝虫病，１９９６年春季又呈爆发流行，仅据礼县统计发病...

四种抗血孢子虫药对驽巴贝虫病的疗效试验

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驽巴贝虫metacaspase基因的克隆、表达、反应原性鉴定和生物信息分析

目的 克隆、表达驽巴贝虫精氨酸/赖氨酸特异性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(BcMC),鉴定其反应原性并分析其生物学信息。方法 根据驽巴贝虫部分基因序列设计并合成Bcmc基因扩增引物,采用PCR扩增Bcmc基因并克隆至原核表达载体pET-28a,提取质粒pET-28a-Bcmc进行双酶切、PCR和测序鉴定,将重组质粒转入感受态细胞大肠埃希菌BL21 (DE3),优化诱导条件后,选择最适异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度、诱导温度和时间诱导,采用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的表达情况。用His标签蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白后,以驽巴贝虫感染阳性马血清为一抗,Western blotting分析重组蛋白的反应原性。采用ProtParam等生物信息学在线软件预测Bcmc基因的理化性质、磷酸化位点、亚细胞定位、抗原表位、二级和三级结构、蛋白互作网络,对比BcMC与疟原虫属MC-1 (PsMC-1)和泰氏锥虫MC (TtMC)的三级结构。Bcmc序列在NCBI上进行BLAST比对,使用Mega 7.0软件,采用邻接法构建基于mc基因序列的系统进化树。结果Bcmc基因PCR扩增产物约为996 bp,与预期片段一致。重组质粒pET-28a-Bcmc经双酶切、PCR和测序鉴定表明插入的目的基因正确。诱导条件优化结果显示,BcMC重组蛋白在IPTG终浓度为0.8 mmol/L、37℃培养5 h时的表达量最高。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白以包涵体的形式表达,相对分子质量(Mr)约为36 000。Western blotting结果表明,纯化后的BcMC可与驽巴贝虫感染阳性马血清发生特异性反应。生物信息学分析结果显示,BcMC的Mr为36 956.72;具有25个磷酸化点位;亚细胞定位预测位于线粒体的比例为10%;B细胞抗原表位分析发现该蛋白含有12个潜在抗原表位;BcMC蛋白的二级结构中,无规则卷曲占50.30%、α-螺旋占23.19%;BcMC的三级结构与PsMC-1和TtMC相似;蛋白互作网络预测结果显示,与BcMC相互作用的蛋白及BcMC参与的生物过程均与细胞凋亡有关。BLAST比对结果和系统进化树分析结果显示,Bcmc与马泰勒虫(CP099439)、马泰勒虫WA株(XM_004830992)的mc基因序列一致性均为99.90%,进化树上聚为一支,亲源关系较近。结论 BcMC原核表达蛋白具有良好的反应原性,生物信息学分析表明BcMC参与驽巴贝虫凋亡的生物过程。