骨形态发生蛋白2介导同型半胱氨酸促进血管钙化

背景:高同型半胱氨酸血症与血管钙化之间存在一定的内部联系。但是,目前有关高同型半胱氨酸血症促进血管钙化的发病机制还不清楚。目的:探讨骨形态发生蛋白2在高同型半胱氨酸血症诱导血管钙化中的作用。方法:人颈动脉蜡块标本根据有无钙化斑块分为钙化组(n=29)与非钙化组(n=13)。16只ApoE-/-小鼠随机分为对照组和高同型半胱氨酸血症组,每组8只。骨形态发生蛋白2转染大鼠胸大动脉平滑肌A7r5细胞,然后应用梯度浓度同型半胱氨酸(50,100,200,400μmol/L)干预A7r5细胞。茜素红染色和苏木精-伊红染色法检测钙化反应,免疫荧光法检测骨形态发生蛋白2与Runt相关转录因子2相互作用关系,免疫组化法和Western blot检测骨形态发生蛋白2、Runt相关转录因子2、α-平滑肌肌动蛋白的表达。结果与结论:①人体颈动脉组织染色显示,与非钙化组比较,钙化组炎性细胞增多,钙化阳性率增加(P<0.05);与非钙化组比较,钙化组骨形态发生蛋白2和Runt相关转录因子2表达量均上调,α-平滑肌肌动蛋白表达量下降(P均<0.05);②小鼠动脉标本染色显示,高同型半胱氨酸血症组钙化面积阳性率高于对照组(P<0.05);高同型半胱氨酸血症组血清同型半胱氨酸水平明显高于对照组(P<0.05);与对照组比较,高同型半胱氨酸血症组骨形态发生蛋白2和Runt相关转录因子2表达量均上调,α-平滑肌肌动蛋白表达量下降(P均<0.05);③A7r5细胞培养分析,随着同型半胱氨酸浓度梯度增加,A7r5细胞钙化程度、骨形态发生蛋白2和Runt相关转录因子2的蛋白表达增加(P<0.05),α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达降低(P<0.05);④过表达骨形态发生蛋白2的A7r5细胞培养分析,骨形态发生蛋白2过表达组较相对应的对照组、β-甘油磷酸钠组和同型半胱氨酸组钙化程度增加;Runt相关转录因子2表达上调(P<0.05),α-平滑肌肌动蛋白表达下调(P<0.05);⑤同型半胱氨酸钙化培养基培养的骨形态发生蛋白2过表达A7r5细胞中骨形态发生蛋白2表达量增加,且Runt相关转录因子2表达量随骨形态发生蛋白2表达量增加而增加;⑥结果表明,骨形态发生蛋白2是高同型半胱氨酸血症调控平滑肌细胞表型转化导致血管钙化的关键靶基因。靶向调控骨形态发生蛋白2可降低高同型半胱氨酸诱导的血管钙化。

雷公藤甲素对大鼠血管钙化过程中骨形态发生蛋白2和Runt相关转录因子2蛋白表达的影响

目的探究雷公藤甲素对大鼠血管钙化过程中骨形态发生蛋白2(BMP-2)和Runt相关转录因子2(Runx2)蛋白表达的影响。方法选取30只雄性清洁级SD大鼠随机分成对照组、钙化模型组和雷公藤干预组,每组10只。对照组给予肌肉注射0.9%氯化钠注射液和单纯花生油灌胃;钙化模型组给予肌肉注射维生素D3和尼古丁溶于花生油灌胃处理,制作胸主动脉钙化模型;雷公藤干预组在钙化模型组处理的基础上加用雷公藤甲素干预。喂养4周后处死大鼠,取胸主动脉,用von Kossa染色及苏木精-伊红染色反映血管钙化情况,检测血管钙含量和碱性磷酸酶(ALP)活性,蛋白质印迹法检测BMP-2、Runx2蛋白表达。结果von Kossa染色结果显示,与钙化模型组相比,雷公藤干预组血管中膜棕黑色颗粒显著减少,显示血管钙化程度较轻。苏木精-伊红染色结果显示,雷公藤干预组大鼠动脉组织血管内膜破坏不明显,中膜钙化灶钙化程度较钙化模型组明显减轻。雷公藤干预组血管组织中钙含量和ALP活性明显低于钙化模型组[(31.9±2.3)μmol/g protein比(47.6±3.6)μmol/g protein、(82.4±0.9)U/g protein比(149.6±2.7)U/g protein](均P<0.05)。蛋白质印迹法检测结果显示,与钙化模型组相比,雷公藤干预组血管组织中BMP-2和Runx2的表达水平显著下调。结论雷公藤甲素具有减轻血管钙化的作用,这种作用可能与雷公藤甲素抑制参与血管平滑肌细胞成骨转分化的重要信号通路上BMP-2/Runx2蛋白的表达有关。

Smads及其相关转录因子与骨形态发生蛋白诱导成骨的信号传导

目的 综述有关骨形态发生蛋白 (BMPs)诱导成骨的信号传导机制 ,深入了解 BMPs基础及应用研究的理论依据。 方法 查阅近期相关文献 ,了解 BMPs相关蛋白 (Smads)及其相关转录因子在 BMPs诱导成骨的信号传导中的作用。 结果 BMPs的信号传导过程是 :BMPs首先与 型受体和 型受体结合 , 型受体磷酸化 Smads,Smads进入核内与转录因子相互作用影响相关蛋白的转录。Smads可分为受体调节 Smads(R- Smads:Smad1、2、3、5、8和9)、共同介导者 Smad(Co- Smad:Smad4 )和抑制性 Smads(I- Smads:Smad6、7)。 Smad1、Smad5和 Smad8,可能还有Smad9涉及 BMPs的信号传导。多种激酶如局部粘连激酶 (FAK)、Ras-细胞外信号调节激酶 (ERK)、磷脂酰肌醇 3激酶(PI3K)和 Akt丝 /苏氨酸激酶与 Smads的信号传导有关。与 Smad1和 Smad5相关的转录因子有核心结合蛋白 A1(CB-FA1)、Smad相互作用蛋白 1(SIP1)、鸟氨酸脱羧酶拮抗酶 (OAZ)、激活蛋白 - 1(AP- 1)、蟾蜍腹侧形成同源框蛋白 - 2(Xvent- 2 )、生长抑素 (Ski)、抗增殖蛋白 (Tob)、同源结构域转录因子 - 8(Hoxc- 8)等。CBFA1与转化生长因子 - β和 BMP- 2信号传导有关 ,能与 Smad1、2、3、5相互作用 ,在骨形成中起重要作用。锁骨、颅骨发育不良被认为是

前交叉韧带离断骨关节炎大鼠印第安刺猬蛋白以及Runt相关转录因子2的表达

背景:印第安刺猬蛋白(Ihh)及其信号蛋白Gli1以及Runt相关转录因子2(Runx2)是骨关节炎密切相关的因子,在骨关节炎发病过程中,是引起关节退行性改变的重要原因之一。目的:探索Ihh,Gli1以及Runx2在骨关节炎发病过程中的作用。方法:将30只SD大鼠随机分成对照组(n=10)和模型组(n=20)。模型组大鼠取一侧膝关节行前交叉韧带离断建立骨关节炎模型,分别于造模后4周及12周,各取10只大鼠进行观察。对照组大鼠仅暴露前交叉韧带,于术后12周进行观察。结果与结论:与对照组相比,造模4周后可见骨关节炎模型大鼠膝关节出现软骨退变,膝关节软骨中Ihh,Gli1及Runx2表达水平明显增高,而造模12周后软骨退变进一步加重,但膝关节软骨中Ihh,Gli1及Runx2表达水平下降。提示Ihh,Gli1及Runx2在骨关节炎退变过程中起重要作用,其表达水平在骨关节炎的早期即明显升高,可作为骨关节炎防治研究中的评价指标。

雌激素受体β基因沉默对人成骨细胞转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响

背景:雌激素受体β基因参与骨代谢的研究较少,其对骨代谢的具体调节机制仍不清楚。目的:分析雌激素受体β基因沉默对人成骨细胞转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响。方法:实验分3组:空白对照组(即h FOB 1.19,未感染任何反转录病毒)、阴性对照组(即含无效干扰片断雌激素受体β-sh RNA-nc)、最佳RNAi组(即ERβ-sh RNA-3)。将前期最佳RNAi组的雌激素受体β-sh RNA反转录病毒载体感染人成骨细胞,通过抗性筛选并扩大培养,利用MTT法检测雌激素受体β稳定抑制后对细胞增殖的影响;随后在雌激素干预下,通过Western blot技术检测雌激素受体β蛋白表达的稳定抑制效率,并使用半定量RT-PCR和Western blot技术检测雌激素受体β稳定抑制后对转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响。结果与结论:(1)成功筛选出稳定感染ERβ-shR NA-3反转录病毒载体的人成骨细胞,MTT法检测显示雌激素受体β稳定抑制后对细胞的增殖没有明显影响(P>0.05);(2)在雌激素干预下,雌激素受体β蛋白的抑制率为(93.11±0.57)%(P<0.05),且雌激素受体β稳定抑制后对转化生长因子β1 mR NA和蛋白的上调率分别为(26.65±3.81)%和(23.79±3.76)%,骨形态发生蛋白2 mR NA和蛋白的上调率分别为(16.62±1.71)%和(18.08±3.20)%(均P<0.05);(3)结果提示雌激素受体β可能通过调控转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2的表达在骨代谢中发挥作用。

重组人骨形态发生蛋白2晚期自体骨痂成骨对血管内皮生长因子表达的影响

背景:重组人骨形态发生蛋白2和重组人骨形态发生蛋白7治疗骨缺损已经应用于多种实验动物模型。作者前期实验在兔自体髂骨与骨痂骨等长骨骨折治疗中应用,已取得满意效果。目的:验证采用骨折断端周围晚期自体骨痂复合重组人骨形态发生蛋白2移植治疗骨缺损效果,并观察血管内皮生长因子对骨折愈合的影响。设计、时间及地点:随机对照实验,于2008-08/2009-01在本溪市中心医院科研实验室和中国医科大学附属二院实验动物中心完成。材料:2.0～2.5kg的成年健康日本大耳白兔20只。方法:将兔行双侧桡骨中段模拟骨折,12周后观察至明显骨痂生长随机分配实验Ⅰ组10只,实验Ⅱ组10只。在原骨折部位手术,切除骨痂备用,同时切除骨折端使之缺损1.5cm,实验Ⅰ组,左桡骨移植复合重组人骨形态发生蛋白2骨痂为为骨形态发生蛋白2骨痂组,右桡骨移植髂骨为移植自体髂骨组,实验Ⅱ组,左桡骨移植晚期自体骨痂为移植晚期自体骨痂组,右桡骨空白对照为空白对照组。主要观察指标:于术后14d取标本检测各组兔血管内皮生长因子基因mRNA表达水平的。结果:骨形态发生蛋白2骨痂组、移植髂骨组的血管内皮生长因子mRNA及蛋白表达水平差异无显著性意义(P>0.05);移植晚期自体骨痂组、空白对照组血管内皮生长因子未见明显表达。骨形态发生蛋白2骨痂组、移植髂骨组的血管内皮生长因子蛋白表达及基因表达明显高于移植晚期自体骨痂组、空白对照组(P<0.05)。结论:骨折断端周围晚期自体骨痂复合重组人骨形态发生蛋白2明显促进血管内皮生长因子的合成分泌,对促进骨缺损愈合有积极意义。

骨形态发生蛋白-2在骨髓源性心肌干细胞向心肌分化中的作用

目的研究骨形态发生蛋白-2(BMP-2)对骨髓源性心肌干细胞(MCSC)向心肌分化的作用,探讨MCSC向心肌分化中的BMP-2信号转导机制.方法从SD大鼠骨髓中筛选MCSC,用BMP-2诱导向心肌定向分化.RT-PCR检测诱导前后BMP-2受体BMPRIA和BMPRII、心肌早期转录因子Nkx2.5和GATA-4以及cTnT mRNA的表达.免疫细胞化学标记诱导后细胞cTnT和Cx-43的表达.结果用BMP-2诱导后,MCSC的形态和排列发生变化.RT-PCR检测结果显示,诱导前BMPRIA和BMPRII以及Nkx2.5和GATA-4呈低表达,诱导后1周表达增加,3～4周表达明显.cTnT mRNA在诱导前不表达,诱导后1周开始表达,3～4周表达明显.免疫细胞化学染色显示,cTnT和Cx-43从诱导后2周开始表达.3～4周cTnT表达增强,呈现密集的横纹样结构.Cx-43在2周位于细胞膜下,3周分布于相邻细胞连接处,4周呈颗粒状密集分布于肌管的相邻细胞连接处. 结论BMP-2通过BMPRIA和BMPRII的介导作用诱导MCSC分化为心肌细胞.

miR-192-5p靶向CKIP-1促进骨质疏松患者骨髓间充质干细胞成骨分化

背景:酪蛋白激酶2结合蛋白1(casein kinase 2-interaction protein-1,CKIP-1)是一种重要的骨形成负调控基因,其敲除鼠骨质显著增强、骨形成和骨密度也显著提高。而miRNA作为较早发现的小分子调控物,对大多数编码基因具有调控作用,在成骨分化中发挥重要作用。目的:探讨miRNA/CKIP-1对骨质疏松患者骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其分子机制。方法:采用miRNA-Seq技术检测2022年3-6月在开封市中心医院骨外科就诊32例骨质疏松患者及同期体检中心健康人群骨髓间充质干细胞中miRNA的变化情况;利用Targetscan网站预测靶向调控CKIP-1的miRNA,利用荧光素酶报告基因实验检测miRNA与CKIP-1启动子区DNA的结合;在骨髓间充质干细胞中转染miR-192-5p类似物(miR-192-5p mimics)/阴性对照(NC mimics)或miR-192-5p抑制剂(miR-192-5p inhibitor)/阴性对照(NC inhibitor),成骨诱导后第7,14天,通过实时荧光定量PCR技术及茜素红染色检测成骨标志基因Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素、抗骨桥蛋白、骨唾液蛋白及CKIP-1的表达水平和骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的情况;采用蛋白质免疫印迹实验及茜素红染色检测miR-192-5p/CKIP-1/轴对细胞成骨分化的的调控作用。结果与结论:与健康组相比,骨质疏松组有16个miRNA表达明显升高,53个miRNA表达明显降低(P<0.05);利用Targetscan网站预测,并通过荧光素酶报告基因实验验证,发现miR-192-5p与CKIP-1有互补的核苷酸序列(P<0.05);过表达miR-192-5p,Runx2、骨钙素、骨桥素和骨唾液蛋白的表达水平显著升高(P<0.05),抑制miR-192-5p,Runx2、骨钙素、骨桥素和骨唾液蛋白的表达水平显著降低(P<0.05),而沉默CKIP-1的表达后,Runx2、骨钙素及骨桥素的蛋白水平增加(P<0.05),逆转了敲低miR-192-5p对细胞成骨分化的抑制作用。上述结果证实,miR-192-5p在骨质疏松症中表达降低;miR-192-5p通过靶向抑制CKIP-1的表达,促进骨髓间充质干细胞成骨分化。

MSCs成骨分化中BMP2对成骨转录因子SATB2表达的调控作用

目的探索间充质干细胞(MSCs)成骨分化中骨形态发生蛋白2(BMP2)对成骨转录因子SATB2表达的调控作用。方法体外培养小鼠间充质细胞系C2C12,腺病毒介导的BMP2(Adv-BMP2)诱导其向成骨细胞分化,建立并验证C2C12细胞成骨分化细胞模型。Real-Time PCR和Western blotting分别检测C2C12细胞成骨分化过程中经不同浓度Adv-BMP2处理不同时间时SATB2 mRNA和SATB2蛋白表达;以经相应浓度Adv-β-Gal处理细胞作对照。结果经150 pfu/cell Adv-BMP2处理C2C12细胞5 d后,成骨细胞标志基因Ⅰ型胶原、骨唾液酸蛋白和骨钙素表达以及碱性磷酸酶活性均显著增加,MSCs成骨分化模型构建成功。150 pfu/cell Adv-BMP2诱导C2C12细胞成骨分化过程中,SATB2 mRNA和SATB蛋白表达随分化进程而增加;Adv-BMP2浓度为0～225 pfu/cell时,SATB2表达随Adv-BMP2浓度升高而增加。结论 BMP2可调控SATB2的表达,从而影响MSCs成骨分化。

氟砷联合暴露对大鼠骨组织骨形态发生蛋白2和骨形成相关因子Runt转录因子2基因转录表达的影响

目的观察慢性氟砷联合暴露对大鼠骨组织骨形态发生蛋白2（BMP．2）和骨形成相关因子Runt转录因子2（Runx2）基因转录表达的影响及交互作用。方法选取160只8同龄清洁级Wistar大鼠作为研究对象，体重为（200±50）g，根据2X4析因实验设计按体重采用随机数字表法分成16组，每组10只，雌雄各半。用氟化钠（NaF：空白对照0．0mg／kg、低氟5．0mg／kg、中氟10．0mg／kg、高氟20．0mg／kg）和亚砷酸钠（NaAsO2：空白对照0．0ms／ks、低砷2．5ms／ks、中砷5．0mg／ks、高砷10．0mg／kg）灌胃，每周连续灌胃6d，停灌1d，共连续灌胃6个月。依据上述因素将大鼠分为对照组（F0.0As0.0）、低氟组（F50As0.0）、中氟组（F100As0.0）、高氟组（F20．0As0.0）、低砷组（F0.0As2.5）、中砷组（F0.0As5.0）、高砷组（F0.0As100）、低氟低砷组（F5．0As2.5）、低氟中砷组（F5.0As5.0）、低氟高砷组（F5.0As10.0）、中氟低砷组（F10.0As2.5）、中氟中砷组（F10.0As5.0）、中氟高砷组（F10．0As10.0）、高氟低砷组（F20.0As2.5）、高氟中砷组（F20.0As5．0）、高氟高砷组（F20.0As10.0）。采用氟离子选择电极法检测尿氟（UF），原子荧光光谱法检测尿砷（UAs），实时荧光定量PCR法检测BMP-2及Runx2mRNA表达水平。结果F0.0As0.0组、F0．0As2.5组、F0.0As5.0组、F0.0As10.0组均无氟斑牙出现，其余各组均出现不同程度氟斑牙。氟斑牙的发生与染氟剂量存在剂量．反应关系，在高氟（20．0mg／kg）剂量下，随染砷剂量增加氟斑牙损伤程度增加（x2=9．124，P〈0．05）。与F0.0As0．0组（0．99±0．08、0．99±0．07）比较，F5.0As0．0、F10.0As0.0、F20.0As0.0组骨组织BMP-2mRNA水平（1．01±0．07、1．06±0．06、1．21±0．05）及Runx2mRNA水平（1．03±0．04、1．24±0．03、1．33±0．10）随染氟剂量的升高均有升高趋势。氟对BMP-2及Runx2mRNA表达有主效应（F=3．067、2．927，P均〈0．05）；氟砷联合对BMP-2及Runx2mRNA表达存在交互作用（F=3．817、4．802，P均〈0．05）。结论氟砷联合暴露对大鼠骨组织BMP．2及Runx2mRNA表达作用主要表现为氟的主效应，砷间接参与氟致骨毒性过程，氟砷联合对BMP-2及Runx2mRNA表达的交互作用主要表现为拮抗作用。

获得性异位骨化的分子生物学机制

背景:异位骨化是一个动态发展的过程,临床中不同亚型的异位骨化具有不同病因或诱导因素,但在异位骨化中后期进展阶段又表现出相似的病理过程,其中由于创伤等因素引起的获得性异位骨化具有较高的发病率。目的:对近年获得性异位骨化发生发展相关分子生物学机制研究进行综述。方法:以“分子生物学,异位骨化,机制”为检索词在中国知网、万方医学数据库进行检索,以“molecular biological,heterotopic ossification,mechanisms”为检索词分别在PubMed、Embase、Web of Science及Google Scholar数据库进行检索,检索时限为2016年1月至2022年8月,并根据获得文献进行补充检索,对所得文献进行筛选,最终纳入131篇文献进行综述分析。结果与结论:①获得性异位骨化的发生和发展是一个动态的过程,具有一定的隐匿性,因此该疾病的诊疗有一定的困难。②文章通过综述国内外相关文献,发现获得性异位骨化涉及骨形态发生蛋白、转化生长因子β、Hedgehog、Wnt及mTOR共5条主要信号通路,同时在局部微环境中涉及到Runx2、血管内皮生长因子、缺氧诱导因子、成纤维细胞生长因子及Sox9共5项核心枢纽因子,核心机制可能是不同信号通路之间的相互作用,影响机体成骨细胞前体细胞、成骨细胞微环境以及与此相关的细胞因子,进而影响机体骨代谢并导致获得性异位骨化的发生。③未来可以以异位骨化相关单细胞的成骨内稳态为研究方向,以成骨细胞前体细胞-成骨微环境-信号通路及细胞因子作为研究要素,探索各部分要素在不同时空条件下的特征,比较不同种类、不同个体细胞成骨内稳态异同,从整体视角观察异位骨化分子信号网络调控机制,有利于未来临床防治异位骨化新方法的探究。④以中医药及靶向治疗为代表的治疗方法是近年的研究热点,如何将中医药与体内成骨稳态联系,并与靶向治疗相结合,也是未来研究方向之一。⑤目前获得性异位骨化的研究仍多限于基础实验研究,临床防治方法仍存在疗效不确切及不良反应明显等缺陷,相关靶向防治药物临床应用安全性及有效性仍有待验证,如何以基础实验研究为基础,结合发生发展机制,为临床防治提供新方向将是未来研究的重点。

富血小板纤维蛋白对人牙槽骨骨髓间充质干细胞中Runx2、miR-17及BMP2表达的影响

目的:比较雌激素(estrogen,EST)和富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)对人牙槽骨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)中Runt家族相关转录因子2(runt-related transcription factor2,Runx2)、微小RNA17(microRNA,miR-17)及骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)表达的影响。方法:在临床拔牙过程中收集牙槽窝内的骨屑,经酶消化法体外分离培养得BMSCs,并于显微镜下观察细胞的生长形态。实验分为3组,雌激素(estrogen,EST)处理组(EST组,浓度10-8 mol/L)、富血小板纤维蛋白治疗组(PRF组)及对照组(DMEM完全培养基组)。3组细胞经培养后采用MTT法检测细胞增殖率,采用酶标仪检测碱性磷酸酶活性,RT-qPCR检测Runx2、miR-17表达水平,Western blot法检测BMP2表达水平。结果:3组细胞培养7 d后细胞数量、碱性磷酸酶活性达到最高水平,随后增殖速率逐渐减慢,其中PRF组、EST组细胞于第3天开始细胞增殖速率均显著高于对照组(P<0.05)。培养7 d后,PRF组、EST组BMP-2及Runx2蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05)。BMSCs培养7 d后miR-17水平显著降低,而Runx2水平显著增加,其中PRF组、EST组在培养7 d时表达水平显著优于对照组(P<0.05)。结论:雌激素、富血小板纤维蛋白均可有效促进人牙槽骨BMSCs中Runx2、miR-17及BMP2的表达,从而有利于BMSCs的增殖、分化。

miR-133a调控RUNX2/BMP2信号通路参与激素性股骨头坏死的机制

目的探讨微RNA(miR)-133a调控生长相关转录因子2(RUNX2)/骨形态蛋白2(BMP2)信号通路参与激素性股骨头坏死(SONFH)的机制。方法收集本院接受髋关节置换SONFH患者(SONFH组)骨髓及股骨颈骨折不愈合患者(对照组)骨髓,提取骨髓间充质干细胞(BMSCs),经表型鉴定、成骨、成脂分化鉴定后检测BMSCs miR-133a、RUNX2 mRNA和蛋白表达水平,双荧光素酶鉴定miR-133a与RUNX2的靶向关系。实验分组包括对照组、SONFH组、抑制剂对照组(inhibitor con组)、miR-133a抑制剂组(miR-133a inhibitor组)、miR-133a inhibitor+si-RUNX2组。实时定量PCR(RT-qPCR)检测细胞中miR-133a、RUNX2 mRNA水平;Western blotting检测BMSCs中RUNX2、BMP2、骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)蛋白水平;CCK-8检测细胞增殖情况;茜素红染色鉴定细胞矿化能力。结果BMSCs细胞表型鉴定结果显示,细胞表面CD71、CD44表达,CD34、人类白细胞抗原DR等位基因不表达;成骨分化鉴定显示BMSCs出现矿化结节,结节呈红色散落分布;成脂分化鉴定显示BMSCs中脂滴呈橙红色,脂滴沉着细胞,且数量较多,部分细胞内脂滴融合变大成泡状,细胞核位于中央或挤向外周,提示BMSCs提取成功。miR-133a与RUNX2靶向关系存在特异性结合位点。与对照组比较,SONFH组BMSCs中miR-133a水平升高(P<0.05);RUNX2 mRNA和蛋白水平,24、48、72 h时BMSCs的吸光度值,BMSCs矿化结节相对数量,BMP2、BGP、COL-Ⅰ蛋白水平均显著降低(均P<0.05)。与SONFH组、inhibitor con组比较,miR-133a inhibitor组BMSCs中miR-133a水平降低(P<0.05);RUNX2 mRNA和蛋白水平,24、48、72 h时BMSCs的吸光度值,BMSCs矿化结节相对数量,BMP2、BGP、COL-Ⅰ蛋白水平均显著升高(均P<0.05)。与miR-133a inhibitor组比较,miR-133a inhibitor+si-RUNX2组BMSCs中miR-133a水平升高(P<0.05),RUNX2 mRNA和蛋白水平,24、48、72 h BMSCs的吸光度值,BMSCs矿化结节相对数量,BMP2、BGP、COL-Ⅰ蛋白水平均显著降低(均P<0.05)。结论miR-133a在SONFH患者BMSCs中高表达,抑制miR-133a表达可靶向促进RUNX2的表达,从而促进BMSCs成骨分化和细胞增殖。

强直性脊柱炎患者骨代谢生化指标与BMP-2、RUNX-2基因表达的相关性研究

目的探讨强直性脊柱炎(AS)患者中骨代谢指标和骨形态发生蛋白2(BMP-2)、人类相关转录因子2(RUNX-2)对骨量减少或骨质疏松的内在机制。方法通过检测AS患者与健康对照组的骨密度(BMD),骨代谢指标[骨吸收指标骨钙素(BGP)I型强胶原羧基肽(PICP)、骨碱性磷酸酶(BALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)],BMP-2及RUNX-2的水平,采用直线相关性分析骨代谢指标与BMP-2、RUNX-2表达的相关性。结果不同部位的骨密度发生不同程度的骨量减少和骨质疏松,除BGP外的AS患者血清中骨代谢指标及BMP-2、RUNX-2的表达较正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。患病组转子间的BMD与BGP、BMP-2负相关(r=-0.369,P=0.017;r=-0.103,P=0.016),BMP-2、RUNX-2与腰椎BMD均呈现负相关(r=-0.143,P=0.011;r=-0.132,P=0.011),PICP与腰椎密度呈现正相关(r=0.365,P=0.024)。BMP-2与RUNX-2存在正相关(r=0.354,P=0.023),与TRAP存在负相关(r=-0.248,P=0.036),RUNX-2与BGP、BALP存在正相关(r=0.417,P=0.046;r=0.205,P=0.027),与TRAP存在负相关(r=-0.264,P=0.038)。结论 BMP-2、RUNX-2或许通过影响骨代谢过程,改变骨密度,导致AS的发生,为AS的治疗和预防提供深层的理论依据和临床基础。

酪蛋白激酶2相互作用蛋白1对人牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的探讨酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(casein kinase 2 interacting protein-1,CKIP-1)对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)成骨分化能力的影响。方法收集正常人牙周膜组织,通过组织块培养法分离培养hPDLSCs,将P4代细胞分为空白对照组、阴性对照组(感染对照载体)、CKIP-1 siRNA慢病毒组(感染CKIP-1 siRNA慢病毒)以及CKIP-1组(感染CKIP-1过表达慢病毒)。对各组细胞进行成骨诱导培养21 d,茜素红染色观察细胞矿化结节形成情况,并用分光光度计法对矿化结节进行定量分析,同时利用qPCR技术检测各组Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、碱性磷酸酶(alka-line phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand,RANKL)等,以及骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)信号通路成骨相关调控因子的转录水平。结果阴性对照组与空白对照组各指标间无统计学差异(P>0.05);与阴性对照组比较,CKIP-1 siRNA慢病毒组出现更多的矿化结节(P<0.05),矿化沉积量明显增多(P<0.05),Runx2、ALP、OCN、RANKL等,以及BMP信号通路的转录水平不同程度升高(P<0.05)。结论CKIP-1下调可促进hP-DLSCs成骨分化能力,这与成骨相关调控因子转录水平有关。

低氧诱导因子-1α对骨髓间充质干细胞成骨分化与血管生成相关因子的影响

目的探讨低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)在SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)中对成骨分化和血管生成相关细胞因子的影响。方法分离并培养BMSCs,采用流式细胞术进行鉴定;分别构建上调和下调HIF-1α基因的质粒载体及对照组质粒,使用Lipofectamine?LTX转染试剂将各组质粒分别转染至BMSCs,将细胞分为过表达实验组、过表达对照组、低表达实验组和低表达对照组。各组成骨诱导3、7 d后分别进行茜素红染色;RT-PCR检测目的基因HIF-1α,成骨分化特异标志物Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2),以及血管生成特异标志物血小板衍生生长因子-BB(platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的mRNA表达水平;用Western blot检测目的蛋白HIF-1α及Runx2、PDGF-BB的蛋白表达量。结果流式鉴定BMSCs表面标记物CD29、CD45阳性表达率分别为98.2%和4.2%;RT-PCR结果显示:过表达实验组BMSCs中HIF-1α、Runx2、TGF-β和PDGF-BB的mRNA表达显著升高(P<0.001);低表达组中HIF-1α、Runx2、TGF-β和PDGF-BB的mRNA表达显著降低(P<0.001);Western blot结果显示:过表达实验组BMSCs中HIF-1α、Runx2和PDGF-BB的蛋白表达量均增高(P<0.001),低表达实验组中HIF-1α、Runx2和PDGF-BB蛋白表达量降低(P<0.001)。茜素红染色结果显示,低表达实验组钙结节面积小于其对照组,过表达实验组红色钙结节面积显著大于其对照组,随着成骨诱导时间的增加,各组钙化面积也增大。结论上调和下调HIF-1α后可调控BMSCs的成骨分化及血管生成相关因子表达。

尾侧型同源转录因子-2、肝素结合性表皮生长因子样生长因子和骨形态发生蛋白-4在Barrett食管中的表达及相互关系

目的 探讨食管间质组织中肝素结合性表皮生长因子样生长因子（HB-EGF）和骨形态发生蛋白-4 （BMP-4）在Barrett食管发病中的意义.方法 116例患者根据胃镜下表现和送检标本HE染色结果进行分组.分为对照组（29例）、反流性食管炎（RE）组（32例）、Barrett食管组（35例）、RE治疗组（10例）和Barrett食管治疗组（10例）.采用免疫组织化学法对各组食管黏膜病变组织中尾侧型同源转录因子2（CDX-2）、HB-EGF和BMP-4的表达情况进行检测.应用方差分析比较各组间CDX-2、HB-EGF和BMP-4阳性表达水平的变化,卡方检验分析此三者表达的关系.结果 对照组、RE组和Barrett食管组的CDX 2阳性表达细胞数[（0.0±0.0）/高倍视野（HPF）、（43.1±10.6）/HPF、（67.8±11.3）/HPF]依次升高,三组间差异有统计学意义（F=67.664,P＜0.01）;此三组的HB-EGF阳性细胞数[（6.4±1.4）/HPF、（39.4±13.5）/HPF、（55.8±13.9）/HPF]和BMP-4阳性细胞数[（0.0±0.0）/HPF、（22.6±6.4）/HPF、（25.1±10.3）/HPF]也呈现相同趋势,三组间差异均有统计学意义（FHB-EGF=22.925;FBMP-4=10.463,P均＜0.01）,且除RE组与Barrett食管组的BMP-4表达外,其他各组间两两比较,差异均有统计学意义（LSD检验,P均＜0.05）.CDX-2、HB-EGF和BMP-4在RE治疗组的表达[（21.7±1.7）/HPF、（16.6±5.0）/HPF、（9.2±1.0）/HPF]以及在Barrett食管治疗组的表达[（51.4±8.7）/HPF、（31.0±10.4）/HPF、（12.7±3.9）/HPF]分别低于其在RE组和BE组的表达,差异均有统计学意义（LSD检验,P均＜0.05）.在RE组中,CDX-2的阳性率[31.2％（10/32）]明显低于HB-EGF和BMP-4的阳性率[62.5％（20/32）,56.2％（18/32）],差异有统计学意义（x2=6.275、4.063,P均＜0.05）.但在Barrett食管组中,CDX-2的阳性率[85.7％（30/35）]与HB-EGF、BMP-4的阳性率[88.6％（31/35）,74.3％（26/35）]差异无统计学意义（P均＞0.05）.结论 CDX-2、HB-EGF和BMP-4可能在RE和Barrett食管病程的中发挥重要作用.HE-EGF和BMP-4可能是Barrett食管发生中的早期事件,二者对CDX-2的表达可能具有某种促进作用.HB-EGF和BMP-4有可能成为Barrett食管研究和治疗的新靶点.

阿托伐他汀促进大鼠牙槽骨缺损愈合及对Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的:探讨阿托伐他汀对大鼠牙槽骨缺损的治疗作用,并观察对Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法:30只大鼠随机分为正常组(N组)、模型组(M组)与阿托伐他汀给药组(ATV组),除N组外,其余大鼠均在牙槽骨处制造缺口,构建牙槽骨缺损模型。建模成功后,ATV组灌胃20 mg/kg阿托伐他汀混悬液,N组和M组灌胃等量羧甲基纤维素钠溶液,连续给药21天。末次给药后,尾静脉采血,检测血清骨保护素(OPG)、碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(BPG)浓度。H-E染色观察上颌骨缺损区组织变化情况,并进行Lane Sandhu评分。以抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色检测缺损区破骨细胞数目,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)与蛋白免疫印迹(WB)法检测缺损区分泌型糖蛋白(Wnt)、β连锁蛋白(β-catenin)和RUNT相关转录因子2(Runx2)mRNA及蛋白表达量。采用SPSS 23.0软件包对数据进行统计学分析。结果:与N组相比,M组OPG、ALP和BGP浓度与Lane Sandhu评分降低,破骨细胞数增多。与M组相比,ATV组OPG、ALP和BGP浓度与Lane Sandhu评分上升,破骨细胞数减少。H-E染色可见,N组上颌骨缺损区的骨形成量较多,M组缺损区骨组织较少,ATV组缺损区骨组织量增加。与N组相比,M组上颌骨缺损区Wnt、β-catenin和Runx2 mRNA和蛋白表达量降低。与M组相比,ATV组上颌骨缺损区的Wnt、β-catenin和Runx2 mRNA和蛋白表达量增加。结论:阿托伐他汀可促进牙槽骨缺损模型大鼠牙槽骨缺损愈合,加快缺损处骨重建,该作用可能与Wnt/β-catenin信号通路激活有关。

骨质疏松分子生物学研究专家共识

骨质疏松分子生物学研究在骨代谢分子信号通路、骨质疏松易感基因、骨质疏松相关蛋白、骨质疏松靶向治疗等方向取得了很大进展。核因子κB受体活化因子/核因子κB受体活化因子配体/骨保护素(RANK/RANKL/OPG)信号通路、核因子κB受体活化因子(NF-κB)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶(MAPK/ERK)信号通路、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)信号通路、钙离子(Ca^(2+))信号通路、酪氨酸激酶、蛋白激酶B(Src、Akt)信号通路、蛋白激酶C(PKC)信号通路等骨代谢重要通路,维生素D受体(VDR)基因、低密度脂蛋白相关蛋白5(LRP5)基因、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因、雌激素受体(ER)基因等易感基因,载脂蛋白E(Apo E)、Klotho蛋白(Klotho)、骨形态发生蛋白(BMP)、骨涎蛋白(BSP)等相关蛋白,以直接或间接的方式参与调控骨代谢,作用重叠相互联系,互为结果,已在本专业领域达成共识。

补肾化痰方对去势骨质疏松大鼠BMP2/Smad/RUNX2信号通路及钙沉积的影响

目的:观察补肾化痰方对去势骨质疏松大鼠BMP2/Smad/RUNX2信号通路及钙沉积的影响。方法:6月龄SD大鼠40只,随机分为假手术组、模型组、补肾组和补肾化痰方组,每组10只。补肾组予补肾方灌胃,0.51 g/mL;补肾化痰组予补肾化痰方灌胃,0.94 g/mL,模型组和假手术组予等体积生理盐水灌胃,1 mL/100 g,持续灌胃8周。采用micro CT检测大鼠的骨密度(BMD),采用ELISA检测血清骨形态发生蛋白2(BMP2)、Runt相关转录因子2(RUNX2)、胎球蛋白(Fetuin-A)、基质gla蛋白(MGP)含量,Western blot法检测骨组织BMP2、RUNX2、Fetuin-A、MGP蛋白的表达。结果:模型组、补肾组、补肾化痰方组大鼠骨密度、血清及骨组织BMP2、RUNX2、Fetuin-A的含量、血清MGP水平均低于假手术组,骨组织MGP水平高于假手术组,差异均有统计学意义(P<0.05);补肾组和补肾化痰方组大鼠骨密度、血清及骨组织BMP2、RUNX2、Fetuin-A含量、血清MGP水平均高于模型组,骨组织MGP水平低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。补肾化痰方组血清BMP2、RUNX2、Fetuin-A、MGP高于补肾组(P<0.05);补肾组骨组织BMP2、RUNX2高于补肾化痰方组(P<0.05);补肾组和补肾化痰方组骨密度、骨组织Fetuin-A、MGP比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:补肾化痰方能够提高骨质疏松大鼠的骨密度及血清Fetuin-A的含量,影响BMP2/Smad/RUNX2信号通路。