骨形态发生蛋白10及其突变体在CHO细胞中的表达

为了解决骨形态发生蛋白10(bone morphogenetic protein 10,BMP10)前体蛋白proBMP10在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中由于Furin导致的表达产物不均一问题,构建了proBMP10在Furin酶切识别位点处的突变体proBMP10-1(R313K)和proBMP10-2(R316K),并分别将目的基因定点整合进CHO-K1-BAK-/BAX-基因组,成功构建了稳定表达目标蛋白质的重组CHO细胞株。结果表明,proBMP10-2 (R316K)不再被Furin切割,且具有生物活性,而proBMP10-1(R313K)仍然会被Furin切割。

合浦珠母贝骨形态发生蛋白10(BMP10)基因的克隆与表达分析

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)具有成骨活性,在胚胎发育、组织发生、生殖调控等方面也有重要作用,但在贝类中研究还很少。研究克隆了合浦珠母贝(Pinctada fucata)BMP10基因,命名为Pf BMP10。该基因c DNA长1 752 bp,包含开放阅读框(ORF)1 344 bp,编码447个氨基酸。编码蛋白包含一个N端信号肽、一个前结构域和成熟蛋白区。成熟区包含转化生长因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)结构域,其中含7个半胱氨酸残基。不同发育时期表达分析显示Pf BMP10高表达于担轮期和变态期,提示其可能参与幼体担轮期、变态期的发育调控。组织表达分析显示其在鳃和外套膜高表达,贝壳缺刻实验显示缺刻处理24h后其在鳃和外套膜中的表达量均显著上升,表明Pf BMP10可能与贝壳形成相关。研究结果可为BMP家族基因功能及贝壳形成机理研究提供参考。

重组人骨形态发生蛋白10的表达纯化及其心脏保护功能

目的验证重组人骨形态发生蛋白10(rhBMP10)的心脏保护作用。方法使用CHO细胞表达并纯化rhBMP10;利用多柔比星多次给药构建小鼠心力衰竭模型;使用超声心动图、TUNEL染色等方法评价小鼠心功能变化和心肌细胞凋亡情况。结果本研究成功表达了具有生物活性的rhBMP10;多柔比星造模小鼠的心功能受到严重损伤;心肌细胞凋亡比例显著升高,而rhBMP10处理的小鼠心脏功能和心肌细胞未受到显著影响。结论rhBMP10在减轻多柔比星引起的心脏损伤方面具有积极作用。

骨形态发生蛋白10在中国仓鼠卵巢细胞中的表达、纯化及其生物活性

目的在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)中表达改造后的骨形态发生蛋白10(bone morphogenetic protein 10,BMP10)全长基因,纯化后检测其生物活性,以期获得具有生物活性的BMP10分子。方法于rh BMP10的propeptide与mature chain基因片段之间插入6×his-tag标签及DDDDK(肠激酶识别位点),构建p MH3-rh BMP10-histag-DDDDK质粒,电转入CHO细胞,用500μg/ml G418从单克隆中筛选出稳定表达目的蛋白的重组细胞,悬浮驯化表达8 d后,收集培养液上清,阴离子交换柱和镍柱纯化目的蛋白。采用q-PCR法检测纯化蛋白的体外细胞活性。结果目的蛋白纯化液经SDS-PAGE检测到的条带相对分子质量与目的蛋白理论值相符,Western blot分析可见相对分子质量约48 000、96 000和190 000的3个条带,与目的蛋白单体及多聚体相对分子质量一致。酶切后的目的蛋白可有效刺激P19细胞的标志蛋白(Smad6)表达上调。结论 BMP10 propeptide的存在对BMP10的蛋白活性具有重要作用,改造后的BMP10在CHO细胞中表达具有一定的生物活性。本研究为全长BMP10活性二聚体的制备提供了新的思路。

miR-155在炎症微环境下对牙周膜干细胞成骨分化的调控作用

目的 研究miR-155在炎症微环境下对牙周膜干细胞(periodontal ligment stem cells, PDLSCs)成骨分化的调控作用。方法 将PDLSCs按照不同处理方法分为对照组、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)组、miR-阴性对照(NC)组、TNF-α+miR-NC组、TNF-α+miR-155抑制物组、miR-155组,采用荧光定量PCR检测miR-155、Runt相关转录因子2(recombinant runt related transcription factor 2,Runx2)、骨钙素(osteocalcin, OCN)、Ⅰ型胶原(collagenⅠ,Col-Ⅰ)、骨形态发生蛋白5(bone morphogenetic protein 5,BMP5)、骨形态发生蛋白10(bone morphogenetic protein 10,BMP10) mRNA表达水平;Western blot检测Runx2、OCN、Col-Ⅰ、BMP5、BMP10蛋白表达;茜素红染色检测细胞钙结节形成;双荧光素酶报告基因验证miR-155靶向BMP5、BMP10。结果 与对照组比较,TNF-α组PDLSCs中miR-155的表达水平明显升高,Runx2、OCN、Col-Ⅰ的mRNA和蛋白表达水平以及钙结节形成量降低(P<0.05);与miR-NC组比较,TNF-α+miR-NC组PDLSCs中Runx2、OCN、Col-Ⅰ的mRNA和蛋白表达水平及钙结节形成量降低,差异有统计学意义(P<0.05);与TNF-α+miR-NC组比较,TNF-α+miR-155抑制物组PDLSCs中Runx2、OCN、Col-Ⅰ的mRNA和蛋白表达水平及钙结节形成量明显升高(P<0.05);miR-155靶向负调控BMP5、BMP10表达。结论 炎症微环境下PDLSCs中miR-155表达增加,敲低miR-155可促进炎症微环境下PDLSCs成骨分化,靶向调控BMP5及BMP10是相关分子机制。

归肾丸加减治疗肾虚型卵巢储备功能下降不孕症疗效及对血GDF-9、BMP-10影响

目的:探讨归肾丸加减治疗肾虚型卵巢储备功能下降(DOR)不孕症疗效及对血清生长分化因子-9(GDF-9)、骨形态发生蛋白-10(BMP-10)影响。方法:选取2016年1月-2017年6月本院DOR伴不孕症(肾虚型)患者140例,随机分为观察组与对照组各70例。对照组予以常规西医人工周期激素治疗,观察组在对照组基础上加用归肾丸加减治疗。治疗前后评价中医症状积分,测定血清激素和细胞因子水平,超声监测窦卵泡数(AFC)、最大卵泡直径及卵巢血流参数。随访12个月统计妊娠情况。结果:治疗后观察组临床总有效率(94.3%)、妊娠率(41.4%)均高于对照组(77.1%、15.7%),中医症状积分低于对照组,雌二醇(E;)、黄体生成素(LH)、卵泡雌激素(FSH)水平低于对照组,抗苗勒激素(AMH)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、GDF-9、BMP-10水平高于对照组,AFC、卵泡直径、PSV及EDV均高于对照组,RI、PI低于对照组(均P<0.05)。结论:归肾丸加减治疗肾虚型DOR不孕疗效显著,能够改善临床症状及卵巢功能,提高妊娠率,并可提高血清TGF-β1、GDF-9、BMP-10表达。