骨形态发生蛋白2基因治疗与缓释载体修复骨缺损的比较研究

[目的]比较骨形态发生蛋白2(BMP-2)基因治疗与生长因子缓释方法修复节段性骨缺损效果。[方法]于兔双侧桡骨中段造成1·5cm骨缺损,采用4种方法修复:A组植入转基因骨髓间质干细胞(MSCs)与PLA/PCL(聚乳酸/聚己内酯)支架的复合物;B组植入单纯MSCs与含重组BMP-2的PLA/PCL缓释载体的复合物;C组植入单纯MSCs与PLA/PCL复合物;D组植入单纯PLA/PCL。术后4、8、12周行X线、组织学、生物力学和骨密度等检测。[结果]A组体内植入4周后,成骨细胞和间质细胞呈BMP-2强阳性表达;其成骨速度及成骨质量均明显优于B组,12周时骨缺损完全修复。C组成骨能力较弱,而D组则无新骨形成,残留骨缺损。[结论]BMP-2基因治疗是修复节段性骨缺损的好方法。

PRF复合组织工程骨修复牙周骨缺损中基因的表达及意义

目的探讨组织工程煅烧骨复合富血小板纤维蛋白(PRF)修复牙周骨缺损中BMP-2、骨保护素(OPG)和核因子B受体活化因子配体(RANKL)的表达及意义。方法将36只新西兰大白兔随机均分为4组,制备单侧牙周骨缺损模型,其中3组于骨缺损处分别植入煅烧骨、Bio-oss骨和煅烧骨/PRF复合物,以未植入任何材料者作为空白对照。术后4,8,12周处死动物,获取完整标本,进行大体、Masson染色及免疫组化观察。结果 Masson染色:煅烧骨/PRF组术后8周时即见部分鲜红色成熟骨形成,骨成熟速度明显优于其他3组。免疫组化观察:术后4周时煅烧骨/PRF组BMP-2、OPG、RANKL强阳性表达,数目高于其他3组,差异具有统计学意义(P<0.05)。RANKL阳性细胞的表达在骨改建过程中有不同程度的降低,煅烧骨/PRF组中组中RANKL下降最为明显,差异有统计学意义(P<0.05)。结论煅烧骨/PRF组修复牙周骨缺损会增加BMP-2、OPG、RANKL的表达,通过促进成骨细胞分化成熟而刺激OPG表达升高,抑制破骨细胞,有助于加快牙周骨改建,缩短骨愈合过程。

重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球的制备及检测

目的制备负载重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)壳聚糖纳米微球,并检测其粒径、形态、降解及药理特性,以评估壳聚糖纳米微球作为rhBMP-2缓释载体的可行性。方法以壳聚糖为原料、三聚磷酸钠为交联剂,通过离子交联法制备负载rhBMP-2壳聚糖纳米微球,应用透视电镜观察微球的形态、激光粒径,分析其粒径分布、溶菌酶降解,了解降解特性。通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测rhBMP-2壳聚糖微球的载药率、包封率和释药规律。结果离子交联法制备的壳聚糖纳米微球,平均粒径大小为230nm,成球性较好,包封率和载药率分别为(66.867±4.575)%、(33.437±2.290)μg/mg;体外释药试验rhBMP-2可以从壳聚糖纳米微球中缓慢释放,释放行为符合双向动力学规律,整个释放过程可达30 d。结论离子交联法可成功制备壳聚糖纳米微球并具有缓释rhBMP-2的能力,为进一步应用于骨组织工程研究提供实验依据。

BMP-2表达上调剂的筛选及其抗骨质疏松活性研究

目的筛选上调骨形态发生蛋白2（BMP-2）表达的新型小分子活性化合物，为研发抗骨质疏松药物提供先导化合物。方法应用国家新药（微生物）筛选实验室前期建立的BMP-2表达上调剂的高通量筛选模型，对化合物库中10000余个化合物进行筛选，以染料木素作为阳性对照；应用实时定量 PCR 和 Western blot 方法检测活性化合物对 U-2OS 细胞 BMP-2 mRNA 和蛋白表达水平的影响。在mRNA 水平考察了活性化合物对 Runx2表达的影响， Western blot 法检测活性化合物对 Smad1/5/8蛋白磷酸化水平的影响；用 PNPP 法检测碱性磷酸酶活性，验证活性化合物体外促进成骨细胞分化的作用。结果在 BMP-2表达上调剂模型细胞上筛选得到活性化合物 E19773，其在模型细胞上的 EC50为46.2μmol/L；实时定量 PCR 结果显示，化合物 E19773能够提高 U-2OS细胞 BMP-2和 Runx2的 mRNA 表达水平；Western blot结果显示，Smad1/5/8蛋白磷酸化水平明显升高；碱性磷酸酶结果表明 E19773能够在体外促进成骨细胞的分化。结论化合物 E19773在0.75~50μmol/L 浓度范围内能明显上调 BMP-2的表达，主要通过 Smads 通路来调控细胞成骨分化，是活性较好的 BMP-2上调剂。

骨水泥间隔器表面微观形貌改变对诱导膜内成骨因子表达的影响

背景:目前国内外学者试图通过改变植入材料的种类和形貌、改良诱导膜厚度、光滑程度等机械化学性能来促进植骨生长。目的:比较大鼠股骨骨缺损处不同表面粗糙程度聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥形成的诱导膜在膜内血管化程度和部分成骨因子表达的差异。方法:取48只雄性SD大鼠(购自广州中医药大学实验动物中心)建立大鼠临界尺寸股骨缺损模型,按随机数字表法分为A、B、C、D组,分别在股骨骨缺损处植入表面粗糙度<1.5 m、1.5-2.0 m、5.0-7.0 m、14.0-20.0 m的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥占位器。植入6周大鼠体内诱导膜形成后取出骨水泥周围的诱导膜,苏木精-伊红染色观察诱导膜病理组织形态结构变化,采用Western Blot印迹方法和免疫组织化学染色法对诱导膜中骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1、血管内皮生长因子蛋白进行定量和定性分析。实验获得广州中医药大学动物实验伦理委员会批准,批准号:20181101006。结果与结论:①苏木精-伊红染色显示,4种表面粗糙程度不同的骨水泥均可以形成较为规则的诱导膜,4组诱导膜之间血管化程度和细胞的数量大体相似;②Western Blot印迹检测显示,各组诱导膜内骨形态发生蛋2、转化生长因子β1、血管内皮生长因子蛋白平均含量基本相似(P>0.05);③免疫组织化学染色显示,各组诱导膜内骨形态发生蛋2、转化生长因子β1、血管内皮生长因子蛋白阳性表达基本相似(P>0.05);④结果表明,骨水泥表面粗糙程度改变对诱导膜的组织形态结构和骨形态发生蛋2、转化生长因子β1、血管内皮生长因子表达在6周时无明显影响。

研究两种干细胞体外矿化过程中LIM矿化蛋白1的表达

目的 LIM矿化蛋白1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)是一种胞内非分泌型蛋白,广泛存在于各种组织中,它不仅影响骨基质的矿化而且还是成骨细胞分化和骨形成过程中重要的调节因子。本实验通过检测LMP-1在牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞体外矿化过程中的表达情况,来研究胞内信号转导分子LIM矿化蛋白1对牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞体外矿化的作用,为LMP-1作为成骨调节因子,影响骨基质矿化方面的研究提供参考。方法酶消化法体外培养牙髓干细胞,用挑克隆细胞团的方法对牙髓干细胞进行纯化传代培养。密度梯度离心法体外培养骨髓间充质干细胞。两种细胞分别设置实验组和对照组。实验组培养液中加入矿化诱导液,对照组不加矿化诱导液。分别于培养3、5、7、14天检测碱性磷酸酶的活性。培养21天茜素红染色检测矿化结节形成。培养期间,采用荧光定量PCR方法检测LIM矿化蛋白1、骨形态发生蛋白BMP-2、牙本质涎磷蛋白DSPP和Ⅰ型胶原蛋白COL-1、核心结合因子RUNX-2等成骨标志基因的表达,用SPSS 17.0对结果进行统计学分析。结果培养3、5、7、14天碱性磷酸酶的活性逐渐提高,且实验组碱性磷酸酶的活性显著高于对照组。培养21天实验组可见矿化结节形成。荧光定量PCR检测到实验组及对照组各个基因均表达,且实验组表达显著高于对照组。结论发现LIM矿化蛋白1与牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞体外矿化过程相关,推测LIM矿化蛋白1可能作为检测牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞矿化的一个指标。

硫酸软骨素调配海藻酸钠复合胶对兔骨折愈合的影响

目的探讨海藻酸钠复合胶中加入硫酸软骨素对兔骨折愈合的影响。方法新西兰大白兔72只,适应性喂养1 w,随机分为胶1组、胶2组、丝线组和模型组,每组18只。无菌手术条件下在桡骨上造成一大小为0.8 cm×0.4 cm蝶形骨块,其中胶1组用A胶(海藻酸钠∶羧甲基纤维素钠:硫酸软骨素=6.0∶2.5∶0.75)黏接固定,胶2组用B胶(海藻酸钠∶羧甲基纤维素钠=6.0∶2.5)黏接固定,并在黏接处滴饱和氯化钙溶液5滴,使胶表面形成一层海藻酸钙膜;丝线组以4号丝线将骨块捆扎固定;模型组将骨块放至原位置,不做任何固定;逐层缝合切口,用无菌敷料包扎。术后2 w、4 w和6 w分别对胶1组、胶2组、丝线组、模型组拍摄X线片,观察骨折愈合情况,然后各组于各时间段处死6只取出骨折端进行骨痂组织切片HE染色,镜下观察不同时间段各组骨痂生长情况;采集骨折局部皮下组织,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测不同时间段各组骨折局部皮下组织中骨形态发生蛋白(BMP)、白细胞介素(IL)-6含量。结果术后X线片:胶1组、胶2组术后6 w骨折骨性愈合,位线良好;丝线组骨折线基本消失,骨干外形成陈旧性骨折影;模型组骨折畸形愈合,可见明显骨缺损。HE染色:胶1组、胶2组术后骨软细胞成骨活跃,炎症反较轻,丝线组和模型组肉芽组织增生明显,炎症反应较重。术后2、4、6 w时骨折局部皮下组织中IL-6、BMP的ELISA检测:骨折局部皮下组织中BMP的含量均为胶1组>胶2组>丝线组>模型组(P<0.05);IL-6的水平以丝线组最高(P<0.05),胶1组、胶2组和模型组之间无统计学差异(P>0.05)。结论海藻酸钠和羧甲基纤维素钠的复合胶能有效黏合小骨折块,炎症反应小;硫酸软骨素能促进骨折愈合过程中BMP的表达,在海藻酸钠和羧甲基纤维素钠的复合胶中加入一定比例的硫酸软骨素制成的新型骨黏合剂更有利于骨折的愈合。

骨形态发生蛋白-2碱性成纤维细胞生长因子及Cbfa1在强直性脊柱炎病理性成骨过程中的表达及意义

目的探讨骨形态发生蛋白2（BMP-2）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growthfactor，bFGF）和核心蛋广1结合W子（Cbfa1）在强直件脊柱炎（AS）病理性成骨过程中的表达及意义。方法通过原位杂交技术检测20例AS患者骶髂关节滑膜组织Lj20例股骨颈骨折髋关节置换患者（对照组）髋关节滑膜组织中BMP-2、bFGF和Cbfa1的表达情况，用图像分析系统统计阳性细胞与阴性细胞的灰度值。结果在AS患者骶髂关节滑膜组织中BMP-2、bFGF和Cbfal阳性表达，而对照组髋关节滑膜组织中BMP-2、bFGF和Cbfa1阴性表达，细胞的图像灰度值比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论BMP-2、bFGF和Cbfa1均为AS病理性成骨过程中重要的成骨因子，它们与AS骶髂关节成骨硬化过程密切相关。

rh-BMP-2壳聚糖微球的制备及体外检测

[目的]以壳聚糖为辅料,通过乳化交联法制备新型重组人骨形态发生蛋白-2缓释微球,并对其粒径、载药、体外释药、理化特性及降解特性进行检测,以评估应用生物可降解的壳聚糖微球作为BMP-2缓释载体的可行性。[方法]以京尼平作为交联剂,应用乳化交联法制备具有控制释放功能的负载rhBMP-2壳聚糖微球,应用扫描电镜观察微球的形态和粒径;利用酶联免疫吸附实验(ELISA)动态检测BMP-2壳聚糖微球的载药率、包封率和缓释规律以分析微球的缓释能力。[结果]乳化交联法制备的壳聚糖微球,球形良好,球体表面光滑,具有较高的包封率(>85%)。体外药物释放试验表明,rhBMP-2可以从壳聚糖微球中缓慢释放,整个释放过程可达30 d。[结论]应用乳化交联法制备的负载rhBMP-2壳聚糖缓释微球,具有很好的控制释放rhBMP-2的能力。这种新型药物控制释放系统在细胞因子的控制释放及骨组织工程中有潜在的应用价值。

河北医大第三医院开创骨不连治疗新方法

不久前 该院骨科医师张英泽、王鹏程等,通过实验和临床研究找到了一种促使内源性骨形态发生蛋白(BMP)