HCVC区、E1区基因腺病毒表达载体骨架质粒pAd.HCV-CE1的构建、鉴定及表达

用分别含有BglⅡ及HindⅢ酶切位点的HCVCE1基因上、下游引物 ,以含有HCVH株基因序列的质粒 pBRTM/HCV1 30 11为模板 ,通过PCR扩增获得HCVCE1基因片段 ,定向插入到腺病毒骨架质粒 pAd .CMV Link 1中CMV启动子下游BglⅡ与HindⅢ位点之间 ,获得重组表达质粒 pAd .HCV CE1。通过BglⅡ /HindⅢ双酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行鉴定 ,证实了 pAd .HCV CE1插入片段为HCVCE1区基因片段。以抗HCVC单克隆抗体为一抗 ,利用间接免疫荧光法证实 pAd .HCV CE1可以在人肝癌细胞 772 1中瞬时表达。以上结果初步表明 ,构建的质粒 pAd .HCV CE1可以表达HCVCE1区基因 ,为进一步包装能高效表达HCVCE1基因的腺病毒载体奠定了基础。

高效化学转化菌内同源重组法构建重组腺病毒

目的:对细菌内同源重组法构建重组腺病毒AdEasy系统加以改进,为制备具有更高抗肿瘤疗效的生物治疗制剂奠定基础。方法:将自杀基因CD和HSV-TK插入穿梭质粒pAdTrack-CMV中,PmeⅠ酶切后,用酚∶氯仿抽提、乙醇沉淀或切胶回收纯化;分别采用电穿孔转化法和化学转化法将线性穿梭质粒(pAdTrackCMV-CDglyTK)与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在细菌内实现同源重组;将重组腺病毒质粒rpAdEasyGFP-CDglyTK以脂质体介导至293细胞中进行包装、扩增。结果:采用切胶回收化学转化法获得阳性重组率最高(100%)。经PCR、酶切以及测序等方法鉴定,证实融合自杀基因已成功插入腺病毒中。结论:对细菌内同源重组法构建重组腺病毒的方法进行了改进,在降低实验成本的同时获得了较原法更高的阳性重组率,并成功构建了复制缺陷性重组腺病毒rAd-CDglyTK。

丙型肝炎病毒重要编码蛋白重组腺病毒载体的构建

旨在构建含HCV core、E1、E2、F、NS3、NS5a和NS5b基因的重组腺病毒载体。运用PCR技术扩增目的基因片段,通过酶切连接方法将上述7种基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-TO4中,然后将重组质粒用PmeⅠ线性化后与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌中同源重组。用PacⅠ酶把重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞后产生重组腺病毒颗粒。利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP对其感染效率进行监测。结果显示,酶切鉴定和测序结果均证实含core、E1、E2、F、NS3、NS5a和NS5b基因的重组腺病毒构建成功,在感染的Huh7细胞中观察到绿色荧光蛋白GFP。成功制备了高滴度的腺病毒Ad-core、Ad-E1、Ad-E2、Ad-F、Ad-NS3、Ad-NS5a和Ad-NS5b,为后续研究奠定了基础。

编码绿色荧光蛋白和βARKct的重组腺病毒的制备

【目的】制备编码绿色荧光蛋白(GFP)和G茁γ活性抑制剂茁ARKct的重组腺病毒载体。【方法】构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-茁ARKct,经PmeI线性化后转化入含腺病毒骨架质粒pAdEasy-I的BJ5183菌,筛选获得重组腺病毒质粒pAdEasy-gfp-茁ARKct。用LipoFectamine2000将经PacI线性化的pAdEasy-gfp-茁ARKct转染入人胚肾293细胞,包装并扩增出重组腺病毒颗粒rAd-gfp-茁ARKct。用氯化铯高速梯度离心、纯化rAd-gfp-茁ARKct。用rAd-GFP-茁ARKct干预去甲肾上腺素诱导的乳鼠心肌细胞肥大过程,观察对茁肌球蛋白重链(茁MHC)基因表达的影响。【结果】将pAdTrack-CMV-茁ARKct转入含pAdEasy-I的BJ5183菌后获得20%的阳性重组体克隆。重组腺病毒质粒在293细胞中包装并扩增出大量的腺病毒,经PCR鉴定含有茁ARKct编码基因。透析纯化得到重组腺病毒滴度为6.0×106pfu/mL。rAd-GFP-茁ARKct表达的茁ARKct可抑制乳鼠心肌细胞茁MHC的高表达。【结论】成功构建重组腺病毒载体,并在293细胞中包装、制备出可表达茁ARKct的重组腺病毒rAd-gfp-茁ARKct。

人骨保护素基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建人骨保护素(hOPG)基因的重组腺病毒载体并检测其转染能力。方法采用基因工程技术,将hOPG基因片段插入到腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV上,利用PadEasy系统与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增,得到携带hOPG基因的重组腺病毒AdEasy-PAdtrack-CMV-hOPG,将重组腺病毒AdhOPG对大鼠骨髓基质细胞(rMSCs) 进行感染。采用PCR方法对重组腺病毒载体进行鉴定,利用绿色荧光报告基因转染结果,以荧光计数法检测重组腺病毒的滴度。结果酶切鉴定及PCR结果证明hOPG基因重组腺病毒载体成功, 病毒滴度可达2．5×108pfu／ml,具有很强感染能力,结论应用细菌内同源重组法,成功构建了含 hOPG重组腺病毒载体。

利用PCR方法鉴定hiTAIL-PCR扩增产物中的质粒骨架片段

T-DNA突变体是研究基因功能的重要资源。高效热不对称交错PCR(hiTAIL-PCR)是克隆突变体中T-DNA插入位点侧翼序列的常用方法。然而我们发现,利用hiTAIL-PCR克隆到的一些侧翼序列并不对应于宿主的染色体DNA序列,而是质粒的骨架DNA片段。通过设置1组RB-S4/AC1或者LB-A4/AC1对照反应,用PCR方法鉴定了hiTAIL-PCR扩增产物中位于T-DNA侧翼的质粒骨架片段。在后续分析中,通过排除这些片段,提高了利用hiTAIL-PCR获得宿主染色体DNA片段的效率。同时,通过调整反应程序,使得整个PCR的反应时间也大为缩短。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)T-DNA突变体drf1侧翼序列的克隆实例中,对照反应的引入将hiTAIL-PCR中需鉴定的22条扩增产物降至4条,效率提高了81.8%。

应用AdEasy腺病毒载体系统构建人骨形成蛋白2基因重组腺病毒

目的利用AdEasy腺病毒载体系统构建人骨形成蛋白2(BMP2)基因重组腺病毒并在293E细胞中扩增制备重组病毒。方法自人骨形成蛋白2真核表达载体pcDNA3-hBMP2中酶切出hBMP2基因,插入pAdtrackCMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrackCMV-hBMP2,经酶切线性化后,采用电穿孔转化到事先电转化腺病毒骨架质粒pAdEasy的BJ5183大肠杆菌电感受态细菌中,挑选同源重组质粒,酶切线性化重组质粒并转染293E细胞包装成重组病毒颗粒,荧光显微镜观察绿色荧光表达。重组病毒上清感染293细胞,荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带hBMP2基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论成功地构建了携带hBMP2基因的重组腺病毒载体,为进一步研究rBMP2基因治疗奠定了基础。