血清骨生成诱导因子及miR-22-3p表达水平对2型糖尿病肾病早期诊断价值研究

目的分析血清骨生成诱导因子(osteoinductive factor,OIF)和微小核糖核酸(microRNA,miR)-22-3p在2型糖尿病肾病(type 2 diabetes nephropathy,T2DN)早期诊断中的价值。方法选取2018年3月~2020年3月重庆医科大学附属遂宁市中心医院2型糖尿病患者190例为研究对象,根据24h尿微量清蛋白排泄率(24 hour urinary microalbumin excretion rate,24h UAER)分为糖尿病无肾病组(n=58)、早期糖尿病肾病组(n=62)及临床糖尿病肾病组(n=70)。并以同期体检的健康体检者50例为健康对照组。比较各组血清OIF和miR-22-3p水平,Pearson法分析血清OIF,miR-22-3p表达与肾功能指标的相关性。采用受试者工作曲线分析血清OIF和miR-22-3p及联合检测对早期2型糖尿病肾病的诊断效能。结果糖尿病无肾病组、早期糖尿病肾病组及临床糖尿病肾病组血清OIF(7.81±1.31pg/ml,9.75±1.45 pg/ml,13.44±1.61pg/ml)和miR-22-3p(1.03±0.18,5.43±0.81,7.42±0.95)表达水平均高于健康对照组(6.42±1.22 pg/ml,0.82±0.12),差异有统计学意义(t=5.675~48.790,均P<0.05)。早期糖尿病肾病组血清OIF,miR-22-3p表达高于糖尿病无肾病组(t=7.673,40.436,均P<0.05),临床糖尿病肾病组血清OIF,miR-22-3p表达高于早期糖尿病肾病组(t=13.766,12.863,均P<0.05),差异具有统计学意义。糖尿病无肾病组、早期糖尿病肾病组和临床糖尿病肾病组血清尿酸、糖化血红蛋白、24h UAER表达水平依次升高(t=1.847~47.555,均P<0.05),eGFR表达水平依次降低(t=10.018,5.416,P<0.05),差异均有统计学意义。血清OIF和miR-22-3p表达水平与尿酸、糖化血红蛋白、24h UAER呈正相关(r=0.510~0.604,均P<0.01),与eGFR呈负相关(r=-0.476,-0.408,均P<0.01);血清OIF,miR-22-3p及联合检测对早期2型糖尿病肾病诊断的曲线下面积(area under the curve,AUC)及95%置信区间(95%confidence intervals,95%CI)分别为0.815(95%CI:0.761~0.859),0.726(95%CI:0.706~0.812)及0.893(95%CI:0.849~0.950)。联合检测血清OIF,miR-22-3p对早期糖尿病肾病的诊断效能高于单一指标(Z=2.305,2.616,P=0.018,0.010)。结论2型糖尿病肾病患者血清OIF和miR-22-3p表达升高,两者与尿酸、糖化血红蛋白、24h UAER及eGFR有关,联合检测有助于2型糖尿病肾病的早期诊断。

小鼠骨生成诱导因子基因逆转录病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建小鼠骨生成诱导因子(OIF)基因重组逆转录病毒载体,鉴定其在293T细胞中的表达。方法 PCR法扩增OIF-3FLAG基因,测序后克隆入逆转录病毒载体pMSCV PIG(Puro-IRES-GFP)的相应位点,构建重组逆转录病毒表达载体pMSCV PIG-OIF-3FLAG,并对重组体进行测序鉴定。应用脂质体分别将PMSCV PIG-OIF-3FLAG和VSVG、GAG-POL辅助病毒包装载体共转染至293T包装细胞,48h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达;收集包装细胞上清液,进一步用含有包装病毒的上清液再感染293T细胞,48 h后加入3μg/mL嘌呤霉素(puromycin),连续7d,筛选病毒感染的稳定表达pMSCVPIG-OIF-3FLAG的293T细胞株,分别采用Real-time PCR技术和Western blotting方法检测293T细胞OIF mRNA及其蛋白表达。结果构建OIF基因逆转录病毒表达载体PMSCV PIG-OIF-3FLAG,经酶切及测序鉴定证实目的基因插入位点和读码框架正确;病毒感染293T细胞,经嘌呤霉素筛选稳定表达小鼠OIF的293T细胞株;Real-time PCR和Western blotting鉴定证实OIF mRNA和蛋白在该细胞株中呈高表达。结论成功构建小鼠OIF基因的逆转录病毒载体,并获得稳定高表达OIF基因的293T细胞株。

人骨生成诱导因子基因慢病毒载体构建及在人主动脉平滑肌细胞中稳定过表达

目的:构建人骨生成诱导因子基因(osteoinductive factor,OIF)慢病毒载体,并在人主动脉平滑肌细胞(human aorticsmooth muscle cell,HASMC)中稳定过表达OIF。方法:PCR扩增OIF-3FLAG,并克隆到慢病毒载体pMSCV PIG中,构建慢病毒表达载体pMSCV PIG-OIF-3FLAG,并测序鉴定。应用脂质体将pMSCV PIG-OIF-3FLAG或pMSCV PIG与VSVG、GAG-POL共转染293T细胞,48 h后收集细胞上清,感染HASMC,48 h后加入嘌呤霉素4 d,即筛选出稳定过表达pMSCV PIG-OIF-3FLAG的HASMC细胞株,采用real-time PCR和Western blot检测OIF mRNA和蛋白表达。结果:构建OIF基因慢病毒表达载体pMSCV PIG-OIF-3FLAG,经酶切及测序后证实目的基因的插入位点和读码框正确;包装病毒感染HASMC,经real-time PCR和Western blot检测证实OIF mRNA和蛋白水平在该细胞株中高表达。结论:成功构建人OIF基因的慢病毒载体,并获得稳定过表达该基因的HASMC。

过表达mimecan对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的作用初探

目的应用反转录病毒载体技术构建稳定过表达mimecan的人脐静脉内皮细胞株(HUVEC),并观察过表达mimecan后HUVEC增殖及凋亡的变化。方法应用反转录病毒载体构建稳定过表达mimecan的HUVEC细胞株,real-time PCR和Western blot法检测mRNA和蛋白水平的表达。应用CCK-8方法检测过表达mimecan后HUVEC增殖的变化,应用AnnexinⅤ-PE染色观察过表达mimecan后HUVEC凋亡的变化。结果构建了稳定过表达mimecan的HUVEC细胞株。过表达mimecan后,HUVEC增殖能力降低,凋亡率增加。结论过表达mimecan抑制HUVEC的增殖,促进其凋亡。