软骨胶原蛋白肽的制备、特性及其成骨细胞增殖活性研究

为充分利用鲨鱼软骨资源,本研究以成骨细胞增殖率为指标,在优化促成骨细胞增殖胶原蛋白肽酶解工艺的基础上,分析酶解物的相对分子质量、氨基酸组成及稳定性等。结果表明,酸性蛋白酶为最优蛋白酶,且在酶添加量5 100 U·g^(-1)、料液比1∶50(g·mL^(-1))、酶解时间4.14 h和温度55℃条件下,得率为91.23%。所制酶解物促成骨细胞增殖率与水解度分别为141.23%与25.03%;鲨鱼软骨胶原蛋白肽具有一定的稳定性且对紫外光不敏感,适当加热可以提升其促成骨细胞增殖率,但温度过高会使增殖率显著下降;经胃肠模拟消化后,酶解物促成骨细胞增殖率显著下降;所制酶解物以疏水氨基酸为主,其蛋白肽分子量一般小于3 kDa,具有促进成骨细胞增殖、分化及矿化作用,以浓度1.0 mg·mL^(-1)时效果较佳。本研究可为鲨鱼资源精深加工和高值化利用提供一定理论依据。

15种中西药物含药血清对大鼠成骨细胞增殖成熟的影响

目的 用含药血清体外观察 1 5种中、西药物对大鼠新生鼠颅骨成骨细胞增殖成熟的影响 ,比较它们的作用。方法 将所试药物口饲大鼠 ,每日 2次 ,连续 5次 ,于末次给药后 1h采血 ,分离获得含药血清 ,加入成骨细胞培养液中 ,培养 3d,以MTT法和金氏法测定光密度值 ,探讨对成骨细胞增殖和细胞外液中碱性磷酸酶活性的影响。结果 所试 1 5种药物的含药血清对成骨细胞增殖均无显著作用 ;3种西药、4种中成药能显著增强碱性磷酸酶活性 ,其作用强度分别依次为安雄、特乐定、福善美以及泰格、骨疏康、鹿茸健骨、仙灵骨葆。 6种中医古方对碱性磷酸酶活性无显著增强作用。结论 安雄胶囊 (雄激素制剂 )、特乐定片 (氟制剂 )、福善美片 (双膦酸盐制剂 )和中药泰格胶囊、骨疏康颗粒、鹿茸健骨胶囊。

续断含药血清对成骨细胞增殖的影响及其细胞毒性检测

目的:观察不同浓度续断含药血清的细胞毒性及其对成骨细胞增殖的影响。方法:实验于2001-01/07在中山医科大学附属第二医院脐血库、医学研究中心以及中山医科大学放免检测中心完成。①制备大鼠含药血清:取雌性SD大鼠18只,随机分为3组,续断组6只,空白对照组8只,雌激素组4只,按体质量分别给予续断生药、生理盐水、雌激素灌胃3d后取血,离心后取上清液。②根据文献方法分离、培养人的原代成骨细胞。③含药血清细胞毒性的观察:成骨细胞按1.0×108L-1密度接种培养24h,换成无血清培养液24h后,用含不同续断浓度(100%,50%,25%,12.5%,6.25%,3%)的大鼠血清处理细胞。采用直接计数法和四氮唑蓝法观察不同浓度续断含药血清的细胞毒性。④细胞增殖的定量分析:将培养人成骨样细胞用不同组大鼠血清稀释,分为5%,10%和20%续断组,5%,10%和20%雌激素1组,5%,10%和20%空白对照组,5%,10%和20%雌激素2组。采用氚-胸腺嘧啶和四氮唑蓝法检测细胞增殖能力。结果:①续断含药血清细胞毒性的观察结果:直接计数表明含续断血清浓度12.5%和25%时,细胞生长数量最多,四氮唑蓝法测定A值最高。②续断对成骨细胞增殖的影响:氚-胸腺嘧啶掺入法显示10%续断组,10%,20%雌激素1组,各浓度雌激素2组细胞增殖显著高于空白对照组、5%雌激素1组和5%续断组(P<0.01);四氮唑蓝法显示10%,20%续断组,10%,20%雌激素1组,10%,20%雌激素2组细胞增殖显著高于空白对照组、5%雌激素1组和5%续断组(P<0.01)。结论:高剂量续断对成骨细胞增殖产生抑制作用,低剂量无明显影响,中剂量续断对细胞增殖的刺激作用最强。

rhIGF-1对成骨细胞增殖、分化及骨保护素、骨保护素配体基因mRNA表达的影响

目的 观察不同剂量rhIGF 1对成骨细胞增殖、分化及骨保护素、骨保护素配体mRNA基因表达的影响 ,为明确骨保护素、骨保护素配体在骨质疏松症发病的作用机理及rhIGF 1在临床中的应用提供实验依据。方法 取 2代培养的大鼠成骨细胞 ,在rhIGF 1为 0ng/ml,10ng/ml,2 0ng/ml,5 0ng/ml的浓度中培养。观察细胞的生长及钙结节的形成 ,MTT法、碱性磷酸酶 (ALP)、骨钙素 (OCN)测定细胞增殖和分化 ,RT PCR测定rhIGF 1对成骨细胞骨保护素、骨保护素配体基因mRNA表达的影响。结果 成骨细胞在 7d可铺满瓶壁 ,3 0d可形成钙结节 ,rhIGF 1可促进成骨细胞的增殖、ALP和OGN的分泌 ,促进骨保护素、骨保护素配体基因的表达 ,以促进骨保护素表达明显 ,在rhIGF 1为 10ng/ml时作用明显。结论rhIGF 1可促进大鼠成骨细胞的增殖、分化 ,及骨保护素、骨保护素配体基因mRNA的表达 ,骨保护素mRNA表达显著。rhIGF 1可能通过影响骨保护素、骨保护素配体而调节成骨细胞、破骨细胞的平衡 ,使骨重建 。

补肾活血方对成骨细胞增殖等生物学特性影响的实验研究

目的:观察中药补肾活血方对体外培养SD大鼠成骨细胞增殖、分化、矿化的的影响。方法:取新生的SD大鼠的颅骨,胶原酶法培养成骨细胞。应用MTT法,对硝基苯磷酸盐法(PNPP)及茜素红染色方法观察补肾活血方对体外培养成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性及矿化结节形成的影响。结果:补肾活血方具有刺激成骨细胞增殖,提高碱性磷酸酶活性及矿化结节形成的数量的作用(P<0.01或P<0.05)。结论:补肾活血方具有促进成骨细胞的增殖、分化及矿化作用。

牛初乳提取物(BCE)对成骨细胞增殖及胎鼠骨骼发育的影响

ＮＩＨ小鼠孕期连续服用牛初乳提取物（ＢＣＥ）、活性钙和蒸馏水，孕后第１８天解剖母鼠，检查胎鼠骨骼发育情况。结果表明，ＢＣＥ能显著促进胎鼠骨骼的生长发育，比单纯补钙更有效。用离体培养的新生大鼠头盖骨成骨细胞检测不同浓度的ＢＣＥ和表皮生长因子（ＥＧＦ）的促细胞增殖作用时发现，ＢＣＥ浓度在２μｇ／ｍＬ至２０ｍｇ／ｍＬ之间递增时，其促细胞增殖作用随之加强，继续提高浓度则对细胞增殖产生抑制作用；不同浓度的ＥＧＦ也有促细胞增殖作用，但ＥＧＦ的剂量曲线比较平缓，提示ＢＣＥ的促细胞增殖作用是多种生长因子协同作用的结果。实验结果表明ＢＣＥ具有促进骨骼发育的作用。

不同浓度瘦素对乳鼠成骨细胞增殖及VEGF mRNA表达的影响

目的通过观察不同浓度瘦素对离体培养乳鼠颅骨成骨细胞的作用,探讨瘦素(Leptin)对成骨细胞增殖以及成骨细胞上血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响,为促进骨愈合过程中骨修复、再生的临床治疗提供一定的理论依据。方法取新生24h乳鼠颅盖骨,经酶解消化后得到原代成骨细胞,进行体外培养并鉴定。采用MTT法(噻唑蓝染色法)测定各组的OD值,观察瘦素对成骨细胞增殖能力的影响;采用RT-PCR法测定瘦素作用成骨细胞后VEGF mRNA的表达情况。结果经细胞鉴定后证实其系成骨细胞;经MTT法检测表明,瘦素作用24h后,各实验组OD值随瘦素浓度升高而增加;经RT-PCR法检测表明,VEGF mRNA可在乳鼠成骨细胞内稳定表达;半定量分析表明,不同瘦素剂量组间VEGF mRNA的表达量呈现一定规律,随着瘦素浓度的升高,VEGF mRNA的表达量逐渐增加。结论瘦素可促进成骨细胞增值;VEGF mRNA在成骨细胞内稳定表达;瘦素可上调成骨细胞上VEGF mRNA的表达,并存在一定的剂量依赖关系。

转录因子调控成骨细胞增殖分化研究进展

随着细胞工程学和组织工程学的发展,利用骨组织工程方法或基因治疗方法修复骨缺损逐渐成为热点.成骨细胞在骨形成和骨重塑过程中起着关键的作用,而转录因子在成骨细胞增殖分化过程中不仅可以调节成骨细胞的功能,而且可以决定基质干细胞向成骨细胞分化的方向.

紫杉醇对根尖周炎破骨细胞增殖及分化的影响

背景:研究表明紫杉醇可以治疗骨转移肿瘤,说明紫杉醇对于治疗骨破坏疾病有一定的疗效,但是目前国内外对于紫杉醇治疗骨破坏相关疾病的研究很少,关于紫杉醇调节破骨细胞形成和功能的机制仍然不明确。目的:观察紫杉醇对根尖周炎破骨细胞增殖及分化的影响。方法:体外培养RAW264.7细胞24 h后换RANKL诱导液培养,通过Real-time PCR及抗酒石酸酸性磷酸酶鉴定破骨细胞诱导成功。CCK8检测不同浓度(1,10^(-1),10^(-2),10^(-3),10^(-4),10^(-5),10^(-6) mol/L)的紫杉醇作用后破骨细胞增殖情况,筛选紫杉醇作用于破骨细胞最佳浓度;以未加入紫杉醇的破骨细胞为对照组;采用Real time-PCR和Western blot检测紫杉醇对破骨细胞凋亡的影响。结果与结论:(1)紫杉醇10^(-4) mol/L时,破骨细胞增殖能力开始降低(P <0.05),表明10^(-4) mol/L紫杉醇为作用于RAW264.7细胞的最佳浓度;(2)加入10^(-4) mol/L紫杉醇0,24和48 h,破骨细胞增殖均显著低于未加入紫杉醇对照组(P<0.05);破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶A值的增殖均显著低于未加入紫杉醇对照组(P<0.05);(3)Realtime-PCR检测结果显示,加入10^(-4)mol/L紫杉醇抗酒石酸酸性磷酸酶m RNA表达明显低于未加紫杉醇的对照组(P <0.05),Caspase3和PARP1的蛋白表达明显高于未加紫杉醇的对照组;(4)结果说明,紫杉醇抑制破骨细胞的增殖及分化,并且可以促进破骨细胞的凋亡。

补肾中药对体外培养成骨细胞增殖和功能的影响

目的观察补肾中药活性成分对体外培养成骨细胞增殖和功能的影响。方法体外培养成骨细胞,观察补肾中药含药血清对成骨细胞增殖率和ALP活性的影响。结果补肾中药含药血清对成骨细胞增殖能力和ALP活性有增强作用。结论补肾中药活性成分对体外培养成骨细胞的增殖和功能有促进作用。

密骨片对离体胎鼠颅骨成骨细胞增殖及幼鼠颅骨块钙释放量的影响

目的：探讨补肾法对成骨细胞代谢及骨吸收活性的影响。方法：胎鼠颅骨成骨细胞培养于含有不同浓度的密骨片药液培养基中７２ｈ后，分别采用噻唑蓝比色法和胸腺嘧啶核苦酸渗入法及细胞内骨钙素含量测定３项指标，检测成骨细胞增殖分化情况；用密骨片药液作用于甲状旁腺激素刺激的体外幼鼠颅骨块骨吸收模型，测定培养骨块的钙离子释放量；并与抗骨质疏松药密钙息对照。结果：密骨片药液呈剂量依赖方式促进成骨细胞增殖，提高骨钙素含量，降低骨块钙释放量。结论：密骨片具有促进骨形成，抑制骨丢失作用。

泛素连接酶E3 Nedd4结构域家族对成骨细胞增殖成熟分化的调节

泛素蛋白酶体系统所介导的泛素化修饰在蛋白质的定位、代谢、调节和降解中都起着十分重要的作用，可以说泛素蛋白酶体降解系统是调控蛋白质动态平衡一个必不可少的过程［1］。这一系统中，泛素连接酶 E3作为关键酶，负责确定蛋白质泛素化的特异性，识别靶蛋白底物，并引发蛋白酶体降解蛋白质。所以，E3泛素连接酶是整个泛素化修饰过程的关键因子。在骨骼系统中，成骨细胞作为骨形成的主要功能细胞，其增殖、分化、成熟等各个阶段受到各种细胞因子、转录因子和信号通路的调控。神经前体细胞表达发育调控样蛋白4（Nedd4）是泛素连接酶 E3中具有 E6同源相关蛋白羧基端结构域（HECT 结构域）家族的重要组成部分［2］。此家族的多个成员能够通过泛素化作用调控与成骨细胞增殖分化凋亡相关的信号通路，如转化生长因子－β（TGF －β）和骨形态发生蛋白（BMP）、磷酸化的促分裂原活化蛋白激酶2（MEKK2）等经典通路。所以，泛素蛋白酶体系统也与成骨细胞的周期、增殖、凋亡、分化等活动密切相关。泛素化酶尤其是 Nedd4泛素连接酶 E3家族在其中的作用机制如能被阐明，对解释多种骨科疾病如骨质疏松的发生机制以及治疗靶点有重要意义。近年来，除了经典通路的调节以外，对Nedd4家族的研究也有了很多新的突破。本文就近年来关于泛素连接酶 E3 Nedd4家族调控成骨细胞增殖、分化、凋亡过程的最新研究进展综述如下。

重组胰岛素生长因子1对成骨细胞增殖和分化的影响:量效与时效作用

目的:观察不同浓度重组胰岛素生长因子对成骨细胞的增殖和分化功能的影响。方法:实验于2004-01/06在广东医学院动物中心完成。无菌取出生24h内的Wistar大鼠颅盖骨,进行成骨细胞的分离、培养、增殖,取第5代鼠成骨细胞,在含体积分数0.1的胎牛血清DMEM培养基中,以配制的5种不同浓度重组胰岛素生长因子犤0(对照组),1,10,20,50μg/L犦中继续培养1,3,5,7d,反映不同浓度重组胰岛素生长因子对成骨细胞增殖的影响,采用四甲基偶氮噻唑盐法在酶标仪上检测吸光度值表示;反映成骨分化作用采用酶标仪检测碱性磷酸酶活性;反映不同浓度重组胰岛素生长因子对成骨细胞脂质代谢的影响采用分光光度计检测丙二醛。结果:①对细胞增殖的量效作用:四甲基偶氮噻唑盐法吸光度值反映细胞增殖的活性,胰岛素生长因子对成骨细胞有明显的刺激作用,能使细胞的增殖率提高。不同浓度重组胰岛素生长因子对成骨细胞均有较强的促进作用,1～20μg/L范围随着浓度的增加,吸光度值随之增高,存在剂量-效应关系,20μg/L重组胰岛素生长因子的刺激作用最强,随浓度增至50μg/L,吸光度值有所下降,重组胰岛素生长因子的刺激作用不再增加。②对细胞增殖的时效作用:重组胰岛素生长因子对鼠成骨细胞的促增殖作用还存在时间-效应的关系,随着培养作用时间的延长,吸光度值增高,作用5d后,吸光度值达到最高峰,促增殖作用最为明显,到第7天后,吸光度值下降。③早期成骨活性:不同浓度的胰岛素生长因子,能促进反映成骨细胞的成骨活性、可作为早期分化指标的骨细胞碱性磷酸酶的表达,1～20μg/L范围随浓度的增加,碱性磷酸酶的表达亦增高,20μg/L组促碱性磷酸酶的活性作用最明显,增至50μg/L,碱性磷酸酶的表达有所下降。④对丙二醛表达的影响:1～20μg/L范围随浓度的增加,丙二醛的表达随之降低,20μg/L组的作用最明显,增至50μg/L,丙二醛的表达略有升高,提示胰岛素生长因子可降低成骨细胞的脂质过氧化物水平。结论:重组胰岛素生长因子可促进成骨细胞的增殖,提高增殖率,并具有量效、时效关系。同时能促进成骨细胞进一步的分化,可促进反映早期分化指标的骨细胞碱性磷酸酶的表达,提高成骨能力,有助于骨坏死修复过程。还具有影响成骨细胞脂质代谢,降低成骨细胞的脂质过氧化物水平的作用。

人参皂苷对大鼠成骨细胞增殖及成骨细胞中PINP、β-CTX分泌的影响

目的：探讨人参皂苷对大鼠成骨细胞增殖及成骨细胞中I型前胶原氨基端前肽（PINP）、β-胶原降解产物（β-CTX）分泌的影响。方法：将出生24 h的SD大鼠头盖骨成骨细胞行体外原代及传代培养,分别在培养液中加入不同浓度（0、1、5、10、20μmol/L）的人参皂苷传代培养21 d,行茜素红染色并于倒置相差显微镜中观察成骨细胞矿化结节,应用Western blotting法测定大鼠成骨组织中PINP、β-CTX表达水平。结果：人参皂苷可促进大鼠成骨细胞增殖及矿化结节形成,且呈时间及浓度依赖性。随着人参皂苷浓度增加及作用时间延长,大鼠成骨细胞中PINP、β-CTX表达水平显著升高（P〈0.05）。结论：人参皂苷可促进大鼠成骨细胞增殖及矿化结节形成,其可能作用机制与人参皂苷可诱导成骨细胞组织中PINP、β-CTX分泌有关。

应力作用下生长因子对成骨细胞增殖和分化的调节

成骨细胞在应力作用下骨改建的发生中起着重要的作用。应力作用下成骨细胞的增殖和分化受到系统因素和局部生长因子的调节,而局部生长因子在其增殖和分化过程中起着重要的作用。本文对TGF-β,IGF和PDGF对应力作用下成骨细胞增殖和分化调节的研究进展进行了综述。

掺锶聚磷酸钙骨修复材料的制备及其对成骨细胞增殖的影响

目的改进聚磷酸钙的力学特性和生物活性,为临床骨修复提供新材料。方法制备掺锶聚磷酸钙骨修复材料,采用万能材料试验机测试抗压强度,并采用噻唑蓝(MTT)比色法考察其对成骨细胞增殖的影响。结果掺锶聚磷酸钙多孔支架的抗压强度为(212.4±5.3)MPa,明显大于聚磷酸钙多孔支架的(172.5±8.3)MPa(P<0.05);掺锶聚磷酸钙多孔支架降解0,7,14,21 d时的抗压强度均大于聚磷酸钙多孔支架,差异均有统计学意义(t=8.907,8.222,8.302,7.445,P<0.05)。MTT比色法结果表明,培养3,4,5 d后,掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙作用的成骨细胞的吸光度(A)值高于阴性对照,差异均有统计学意义(t=2.559,6.000,4.533,2.546,3.574,2.932,P<0.05);培养4,5 d后,掺锶聚磷酸钙作用的成骨细胞的A值高于聚磷酸钙,差异均有统计学意义(t=2.733,2.038,P<0.05)。结论新型骨修复材料掺锶聚磷酸钙具有良好的抗压特性,并能促进成骨细胞的增殖,具有良好的临床应用前景。

中药川芎对成骨细胞增殖的影响研究

目的研究中药川芎对成骨细胞增殖的影响。方法以小鼠成骨细胞株MC3T3-E1为实验对象,以川芎提取液干预作为观察组,以α-MEM培养液干预为对照组。比较两组干预24 h、48 h及72 h的成骨细胞增殖情况(CCK-8值)及ALP活性。结果干预后24 h、48h及72 h观察组的CCK-8值及ALP活性均高于对照组(P<0.05)。结论中药川芎可有效促进成骨细胞的增殖。

自然铜及其煅淬品中金属元素对促进成骨细胞增殖的谱效关系研究

目的探讨自然铜及其煅淬品中Fe、Zn、Mg、Cu等多种金属元素与促进成骨细胞增殖的谱效关系。方法将雄性SD大鼠随机分为空白组、生品组(7.5 g·kg^(-1))和煅淬品组(7.5 g·kg^(-1)),按照相应剂量灌胃给药。采用电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)法测定给药0.5、1、2、3、4、6、8、12 h后大鼠血清中Fe、Zn、Mg、Cu等元素的含量。取新生24 h内的SD大鼠,制备成骨细胞,并以不同时间点含药血清进行干预;采用MTT法测定成骨细胞的增殖情况。采用偏最小二乘回归(PLSR)法对含药血清中的金属元素含量与血清对成骨细胞的增殖作用进行谱效相关性分析,计算偏回归系数与VIP值。结果与空白组比较,除12 h外,其他各时间点的生品组及煅淬品组的成骨细胞增殖率明显升高(P<0.01);在3、4 h 2个时间点,与生品组比较,煅淬品组的成骨细胞增殖率明显升高(P<0.01)。自然铜生品组Fe元素的VIP值>1,煅淬品组中Fe、Mg元素的VIP值均>1,且Fe元素VIP值>Mg元素VIP值;自然铜含药血清中Fe元素与促进成骨细胞增殖作用的相关性最强,其次为Mg、Zn、Cu元素。结论自然铜生品与煅淬品均能促进成骨细胞增殖,与其所含Fe、Zn、Mg、Cu等金属元素有关,且与Fe的相关性最大。