木犀草素对骨肉瘤干细胞增殖的影响

目的研究木犀草素对骨肉瘤干细胞增殖的影响。方法用免疫磁珠分选法分离人骨肉瘤细胞株MG-63中的CD133+骨肉瘤干细胞。MTT法检测0、0.01、0.02、0.04 mg/m L木犀草素溶液对骨肉瘤干细胞增殖的影响。Western blot检测木犀草素对骨肉瘤干细胞Ki67蛋白以及对骨肉瘤干细胞JAK2/STAT3信号通路的影响。结果用免疫磁珠分选法,得到比率为(87.60±5.06)%的骨肉瘤干细胞。通过MTT实验发现,与对照组比较,0.01、0.02、0.04 mg/m L木犀草素能够抑制骨肉瘤干细胞的增殖(P<0.05)。Western blot实验表明,与对照组比较,木犀草素各浓度抑制骨肉瘤干细胞Ki67蛋白的表达(P<0.05)。与对照组比较,木犀草素各浓度组对骨肉瘤干细胞JAK2/STAT3信号通路中p-JAK2和p-STAT3蛋白表达具有抑制作用(P<0.05)。结论木犀草素对骨肉瘤干细胞具有抑制作用。

蛋白激酶Cδ失活对骨肉瘤干细胞增殖、凋亡及相关信号通路的影响

目的探讨短发夹RNA(shRNA)靶向沉默人蛋白激酶Cδ(PKCδ)对骨肉瘤干细胞增殖、凋亡及相关信号通路的影响。方法根据Genbank数据库中PKCδ序列,设计、合成互补并特异性编码其shRNA序列(PKCδ-shRNA-1和PKCδ-shRNA-2),克隆至pRNA6.1-Neo质粒载体后采用Western blotting检测PKCδ蛋白水平,筛选抑制效果最好的shRNA片段转染骨肉瘤干细胞(转染组),设阴性对照组(转染shRNA无意义随机阴性对照序列)和空白对照组(不行转染处理)。采用噻唑蓝(MTT)法检测各组转染24、48、72、96 h后的增殖抑制率,流式细胞术检测各组转染后的细胞凋亡和细胞周期情况,实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因的表达,采用Western blotting检测各组转染96 h后PI3K/Akt及Wnt/β-catenin信号通路中相关蛋白的水平。结果转染PKCδ-shRNA-1和PKCδ-shRNA-2后PKCδ蛋白水平均降低(P<0.05),且PKCδ-shRNA-1的抑制效果优于PKCδ-shRNA-2,故后续实验选择PKCδ-shRNA-1;与其余两组相比,转染组的增殖抑制率、凋亡率及促凋亡基因Bax、Bad的mRNA水平均升高,而Bcl-2水平降低,且在细胞周期上,G_0/G_1期细胞比例升高,但S期和G_2/M期细胞比例均降低,以上差异均有统计学意义(P<0.05);转染组PI3K/Akt通路中的PTEN水平升高、Akt水平降低,Wnt/β-catenin通路中β-catenin、C-myc和Cyclin D1水平均降低(P<0.05)。结论通过shRNA抑制PKCδ基因表达可抑制骨肉瘤干细胞增殖并诱导凋亡和细胞周期阻滞,对PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信号通路激活有一定抑制作用,可能对骨肉瘤的防治有一定价值。

骨肉瘤干细胞起源、分离纯化及鉴定的研究进展

近年来的研究已证实骨肉瘤及其他恶性肿瘤中存在肿瘤干细胞,表明骨肉瘤干细胞在骨肉瘤的发生、发展中起着重要作用,但目前文献还未报道特异性高的标志物用于分选鉴定骨肉瘤干细胞,针对骨肉瘤干细胞治疗的临床应用还有很大的提升空间。该文就肿瘤干细胞学说及其细胞来源、骨肉瘤干细胞分离纯化及鉴定方法、免疫学表型等研究现状进行综述。

骨肉瘤干细胞差异表达microRNA对其干性特性的影响

目的 探讨骨肉瘤干细胞差异表达microRNA(miRNA)及其对骨肉瘤干细胞的干性特性(自我更新、侵袭、凋亡)的影响。方法 采用无血清悬浮培养法和流式分选术分离鉴定骨肉瘤干细胞;分别采用成球实验、体外侵袭鉴定骨肉瘤干细胞的干性特性;高通量测序检测骨肉瘤干细胞中差异表达miRNA;采用定量逆转录PCR(qRT-PCR)技术检测相关差异表达miRNA的情况,验证miRNA结果;相关miRNA抑制剂干扰后,分别进行成球实验和侵袭实验检测miRNA对骨肉瘤干细胞自我更新、侵袭能力和细胞凋亡的影响。结果 成功分离Saos-2的CD133^(+)和CD133^(+)细胞,具有较强的自我更新能力和侵袭能力。与CD133^(+)细胞相比,CD133^(+)细胞的高表达miRNAs共有15个;低表达miRNAs共有2个。采用qPCR技术验证高通量测序差异表达miRNA相关结果,CD133^(+)亚群中miR-33b-3p、miR-3648、miR-4442、miR-5091表达上调,miR-3143、miR-3150a-5p表达下调。抑制相关高表达miRNA(miR-33b-3p、miR-3648、miR-4442、miR-5091)表达后,CD133^(+)细胞的自我更新能力和侵袭均下降,细胞凋亡上升。结论 骨肉瘤干细胞中具有多种差异表达miRNA,其对骨肉瘤干细胞的干性特性具有调控作用。

COX-2抑制剂Mavacoxib对骨肉瘤干细胞增殖、凋亡及相关信号通路的影响

目的探讨COX-2抑制剂Mavacoxib对骨肉瘤干细胞增殖、凋亡及相关信号通路的影响。方法体外培养人骨肉瘤MG-63细胞以获取骨肉瘤干细胞,经Mavacoxib（0、1、10、50、100μmol/L）处理后采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测增殖抑制率的变化,同时采用流式细胞术Annexin-FITC/PI双染法及PI单染法检测不同浓度Mavacoxib处理24、48 h的凋亡情况（早、晚期凋亡率）及48 h的细胞周期情况,Western blotting检测不同浓度Mavacoxib处理48 h的骨肉瘤干细胞中PI3K/Akt及Wnt/β-catenin信号通路的影响。结果在10~100μmol/L范围内,Mavacoxib可呈剂量和时间依赖的方式升高骨肉瘤干细胞的增殖抑制率,差异均有统计学意义（P〈0.05）;与0μmol/L相比,除1μmol/L 24 h的晚期凋亡率无统计学差异,10~100μmol/L的早晚期凋亡率、G0/G1期细胞比例均升高,S期、G2/M期细胞比例均降低（P〈0.05）。Mavacoxib处理后的PI3K/Akt通路中的PTEN水平升高,Akt水平降低;Wnt/β-catenin通路中β-catenin、C-myc和Cyclin D1水平均降低（P〈0.05）。结论 Mavacoxib对骨肉瘤干细胞有毒性作用,且可诱导其凋亡及细胞周期阻滞并抑制PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信号通路的激活。

依维莫司增强阿霉素抑制骨肉瘤干细胞的作用

背景:阿霉素能够抑制骨肉瘤细胞的增殖,但是阿霉素对骨肉瘤干细胞的作用以及依维莫司联合阿霉素对骨肉瘤干细胞的作用未见报道。目的:研究mTOR通路抑制剂依维莫司联合骨肉瘤化疗一线药物阿霉素对骨肉瘤干细胞增殖及侵袭的影响。方法:用免疫磁珠分选法分离人骨肉瘤细胞株MG63中的CD133^+骨肉瘤干细胞。MTT检测0,0.1,0.2,0.4 mg/L阿霉素以及0.2 mg/L阿霉素+20μmol/L依维莫司对骨肉瘤干细胞增殖的影响。Transwell小室检测0.2 mg/L阿霉素和0.2 mg/L阿霉素+20μmol/L依维莫司对骨肉瘤干细胞侵袭的影响。Western Blot检测0.2 mg/L阿霉素和0.2 mg/L阿霉素+20μmol/L依维莫司对骨肉瘤干细胞增殖细胞核抗原、基质金属蛋白酶蛋白表达的影响。结果与结论:(1)阿霉素能在一定质量浓度下抑制骨肉瘤干细胞的增殖,且依维莫司联合阿霉素较单独使用阿霉素时明显抑制骨肉瘤干细胞的增殖,说明依维莫司能够增强阿霉素对骨肉瘤干细胞增殖的抑制作用;(2)与单独使用阿霉素比较,依维莫司联合阿霉素作用于骨肉瘤干细胞后侵袭细胞数明显减少;(3)依维莫司联合阿霉素显著抑制骨肉瘤干细胞增殖细胞核抗原、基质金属蛋白酶蛋白的表达,提示依维莫司能够增强阿霉素抑制骨肉瘤干细胞增殖与侵袭的能力。

骨肉瘤干细胞来源外泌体对T细胞增殖及分化的影响

目的探讨骨肉瘤干细胞(osteosarcoma stem cells,OSCs)来源的外泌体对T细胞增殖及分化的影响及其相关作用机制。方法采用无血清悬浮培养获得OSCs,并利用干细胞标志物流式分选技术进行鉴定。试剂盒提取骨肉瘤干细胞分泌的外泌体(OSCs-exo),利用透射电镜、粒径分析及Western blot实验进行鉴定。将OSCs-exo与PBMC进行共培养,CFSE染色及细胞流式实验检测其对T细胞增殖的影响。Western blot实验检测ERK信号通路中ERK蛋白的磷酸化改变。免疫磁珠分选CD4+T细胞,并将其与OSCs-exo在不同CD4+T细胞亚群诱导分化液中进行共培养,细胞流式实验检测OSCs-exo对后者分化的影响。Western blot实验检测STAT信号通路中磷酸化STAT1、STAT3、STAT5蛋白的表达。结果成功分离获得了OSCs CD133+MG-63,透视电镜、粒径分析及Western blot实验结果表明OSCs-exo为直径在30~100 nm的圆形或椭圆形囊泡结构,其高表达外泌体标志性蛋白CD63、HSP70。CFSE染色及细胞流式实验及Western blot实验结果显示OSCs-exo可能通过抑制ERK蛋白磷酸化抑制CD3+、CD4+、CD8+T细胞的增殖,通过抑制磷酸化STAT1、STAT3蛋白的表达抑制CD4+T细胞向Th1、Th17并促进其向Th2、Treg细胞的分化。结论骨肉瘤干细胞来源的外泌体能够通过下调ERK蛋白的磷酸化抑制T细胞的增殖,并降低磷酸化STAT1与STAT3蛋白的表达以诱导CD4+T细胞向Th2、Treg细胞分化,而抑制其向Th1、Th17的分化,从而下调细胞免疫功能,促进肿瘤的进展。

骨肉瘤干细胞功能性单抗9B8靶向骨肉瘤的实验研究

目的探讨靶向骨肉瘤干细胞单抗9B8的生物学特征及其联合顺铂治疗骨肉瘤的疗效。方法细胞免疫荧光法检测单抗9B8识别的抗原蛋白与骨肉瘤干细胞表明标志物(CD133)在骨肉瘤MG-63细胞中的表达情况。流式细胞术分选出的9B8^(+)细胞检测其自我更新、侵袭和耐药能力。CCK8法检测单抗9B8对MG-63细胞自我更新和顺铂耐药能力的影响。裸鼠体内治疗实验分析单抗9B8联合顺铂对MG-63细胞移植瘤生长的抑制作用。结果免疫荧光显示单抗9B8识别的抗原分子与CD133在MG-63上共定位。9B8^(+)细胞无血清成球、侵袭能力和耐药性高于9B8-细胞。9B8^(+)细胞和9B8-细胞的IC50分别为0.9133和0.4012μmol/L。单抗9B8对MG-63的成球抑制率为55.6%。经单抗9B8处理后的MG-63,耐药能力明显下降,其IC50为0.2191μmol/L。单抗9B8体内治疗结果表明40、10、2.5 mg/kg的9B8组的抑制率分别为80.1%、54.2%和43.9%,40 mg/kg 9B8联合顺铂组抑制率为90.1%,顺铂组抑制率为48.6%。结论单抗9B8是抗骨肉瘤干细胞的功能性单抗。

肿瘤干细胞与骨肉瘤

肿瘤干细胞是存在于恶性肿瘤细胞中为数极少却具有无限增殖并能自我更新的肿瘤细胞。研究证实急性髓系白血病中CD34+CD38-Thy-的白血病细胞即为白血病干细胞,Wnt旁路的异常在白血病的形成中发生着重要作用。已证实实体瘤(乳腺癌、脑肿瘤、前列腺癌及鳞状上皮细胞癌)中存在具有干细胞特性的肿瘤细胞。而骨肉瘤当中存在可能起源于间充质干细胞的肿瘤干细胞。本文即重点描述肿瘤干细胞的研究新进展,及其对骨肉瘤治疗方面的意义。

表柔比星对人骨肉瘤干细胞分离纯化的影响

目的 探讨分离纯化人骨肉瘤干细胞的新途径.方法 体外培养人骨肉瘤U2OS细胞和人骨肉瘤干细胞,免疫荧光检测人骨肉瘤干细胞球中CD105表达.表柔比星处理人骨肉瘤干细胞球,细胞计数试剂盒（CCK-8）法测增殖活性.Western blot法检测表柔比星处理后人骨肉瘤干细胞球Nanog和Oct4蛋白表达.结果 荧光显微镜下可见,人骨肉瘤干细胞球CD105呈阳性表达.表柔比星处理后人骨肉瘤干细胞球生长受抑制.Western blot检测结果显示,2.5 mg/L表柔比星处理组Nanog蛋白和Oct4蛋白相对表达量均为最高且不再增加.2.5 mg/L表柔比星为分离培养人骨肉瘤干细胞的最适浓度.结论 悬浮培养联合表柔比星较传统无血清培养,能更好的分离、纯化人骨肉瘤干细胞.

长期低氧对骨肉瘤细胞增殖与分化的影响

目的观察长期低氧对骨肉瘤细胞增殖、分化及骨肉瘤干细胞自我更新能力的影响。方法采用噻吩蓝(MTT)比色法观察低氧对骨肉瘤细胞系MG63增殖的影响。后续试验分为两组:第1组为低氧处理组,将MG63细胞在低氧环境下培养1周后进行实验;第2组为常氧对照组。应用实时定量聚合酶链反应(real-timePCR)检测两组骨肉瘤细胞的成骨分化基因(Runx2和OC)、胚胎干细胞标志基因Oct3/4、原癌基因c-Myc及低氧诱导因子(HIF)-1α、2α的表达。采用无血清悬浮球培养法观察并比较两组细胞肉瘤球数目和体积的差异。采用免疫组织化学染色法检测两组细胞中HIF-1α和HIF-2α蛋白的表达。结果培养第6、9天,低氧处理组的光密度(D)值为0.128±0.020、0.700±0.060,分别显著高于常氧对照组的0.073±0.050、0.480±0.120(P值均<0.05)。低氧处理组MG63细胞骨肉瘤球的数目为(24±10.97)个,显著高于常氧对照组的(13±3.95)个(P<0.05);低氧处理组MG63骨肉瘤球的体积显著大于常氧对照组。与常氧对照组比较,低氧处理组细胞的成骨标志基因Runx2和OC均显著下调(P值均<0.05),胚胎干细胞标志基因Oct3/4和原癌基因c-Myc表达均显著上调(P值均<0.05),HIF-2α表达显著上调(P<0.05);免疫组织化学染色检测到MG63细胞中有HIF-1α和HIF-2α蛋白表达。结论长期低氧可促进骨肉瘤细胞MG63的增殖,抑制其成骨分化,并促进骨肉瘤球的自我更新能力,增强其干细胞特性。HIF-2α蛋白可能在这些过程中发挥关键作用。