产骨胶原蛋白酶菌种的筛选与鉴定

从堆积骨骼的土样中经初筛、复筛和牛骨粉发酵实验,筛选出高产骨胶原蛋白酶的菌种MBL13(酶活36.80±1.93U/mL)。经形态学观察、生理生化特性、16SrDNA序列分析和傅里叶红外测定细胞结构,鉴定该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),并经牛骨胶原蛋白的酶解对比实验表明,MBL13所产的酶酶解骨胶原蛋白的能力强于标准品骨胶原酶I型(美国)。由于酶解后产生的多肽条带并不是连续的,说明发酵液中的胶原蛋白酶对牛骨胶原蛋白的酶解具有特定的酶切位点。

产骨胶原蛋白酶菌的筛选及发酵条件优化的研究

经初筛和复筛从骨骼厂土样中筛选出高产骨胶原蛋白酶的菌种MBL1,针对其产酶的最佳菌龄和发酵条件进行优化研究。结果表明,最佳接种菌的种龄选用培养24h,接种量为5%,起始pH值为7.0,150ml三角瓶最佳装液量20ml,发酵温度32℃。且在优化后的发酵条件下,该菌产酶酶活较优化前酶活提高了35%,达到49.83U/ml。

Bacillus cereus MBL13-U胶原蛋白酶的分离纯化及其降解动力学分析

胶原蛋白酶是特异性水解天然胶原蛋白或明胶的酶类。为制备新型的骨胶原蛋白酶并探讨其降解胶原蛋白的能力,通过采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-100凝胶层析等分离纯化步骤,从Bacillus cereus MBL13-U菌株的粗酶液中分离纯化出一种特异性降解牛骨胶原蛋白的胶原蛋白酶(bone-specific collagenase,BSC),对该酶的分子质量、底物特异性和降解能力进行了分析,并构建出其降解牛骨胶原蛋白的动力学模型。结果表明:分离纯化的BSC比活力为5.57×103U/mg,纯化倍数达到42.85倍,分子质量约为52.0 k Da。经特异性分析该酶为骨胶原蛋白酶,且有显著的水解I型胶原蛋白的能力。其水解能力优于其他常用的蛋白酶。构建出该酶降解牛骨胶原蛋白的动力学模型为:降解速率R=(583.813 6E_0+1.296 7S_0)exp(-0.119 0DH),水解度DH=8.403 4ln(1+69.473 8(E_0/S_0)t+0.154 3)t,酶的失活常数K4为64.115 7/h。