重组人骨靶向干扰素γ-1b在大肠杆菌中的表达

目的建立人骨靶向干扰素γ-1b的高效原核表达体系。方法从Drug Bank数据库下载人干扰素γ-1b氨基酸序列,在羧基端加上10个天冬氨酸标签作为骨靶向分子。采用大肠杆菌偏爱密码子,DNA Star软件分析获得骨靶向性干扰素γ-1b的基因序列。人工合成基因序列并克隆入pET3c质粒表达载体。将上述pET3c-rhIFNγ-1b-D10重组表达载体转入大肠杆菌BL21,筛选高效表达菌株。分离包涵体,8mol/L尿素溶解,利用镍柱亲和层析纯化重组蛋白。Western blot检测目的蛋白的特异性表达。结果测序结果显示所克隆的骨靶向rhIFNγ-1b基因序列正确,筛选出高效表达菌株。经SDS-PAGE显示在相对分子质量19KD处出现特异的目的蛋白表达带,表达量约占全菌蛋白的30%。表达产物以包涵体形式存在,8mol/L尿素变性后经镍柱亲和层析纯化,纯度大于90%,浓度为0.8mg/mL。Western检测显示在19KD处出现特异性目的条带。结论成功在大肠杆菌中表达了人骨靶向干扰素γ-1b,为研究其生物学活性及用于骨硬化症的治疗奠定基础。

重组人骨靶向干扰素γ的骨靶向性和对巨噬细胞向破骨细胞分化的影响

目的对重组人骨靶向干扰素γ(rhIFNγ-D10)进行体外骨靶向性和促进巨噬细胞向破骨细胞分化的活性分析。方法采用羟基磷灰石体外结合实验分析钙亲和力,表征目的蛋白靶向骨组织能力。分别测定重组人骨靶向干扰素γ(rhIFNγ-D10)和非骨靶向性重组人干扰素γ(rhIFNγ)体外结合羟基磷灰石的能力并加以比较,分析天冬氨酸寡肽对干扰素γ骨靶向性的影响。用RANKL、RANKL+rhIFNγ-D10、RANKL+rhIFNγ、rhIFNγ-D10和rhIFNγ分别诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7向破骨细胞分化,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法评价rhIFNγ-D10对破骨细胞分化形成的影响。结果rhIFNγ-D10体外结合羟基磷灰石的能力明显高于rhIFNγ,说明天冬氨酸寡肽有助于将干扰素γ靶向骨组织。与RANKL对照组相比,RANKL+rhIFNγ-D10组和RANKL+rhIFNγ组破骨细胞分化染色细胞明显减少,说明在RANKL诱导破骨细胞分化条件下,rhIFNγ-D10和rhIFNγ对破骨细胞分化有抑制作用。结论采用大肠杆菌表达的rhIFNγ-D10具有骨靶向性,但未显示预期的促进小鼠巨噬细胞向破骨细胞分化的作用,相反表现出一定的抑制作用,其分子机制有待进一步研究。