骨骼肌特异性钙蛋白酶与蛋白质降解

骨骼肌特异性钙蛋白酶calpain-3是钙蛋白酶系统的一员,与肌细胞生成和细胞凋亡密切相关,同时也被认为参与了蛋白质降解过程。本文主要从骨骼肌特异性钙蛋白酶的结构功能和生理活性,并结合近年来国际上的研究成果来分析骨骼肌特异性钙蛋白酶在骨骼肌蛋白质降解中的作用。

泛素特异性蛋白酶19对烟熏诱导慢性阻塞性肺疾病大鼠模型骨骼肌萎缩的作用及机制

目的通过烟熏制备慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型,研究泛素特异性蛋白酶-19(USP-19)在COPD相关骨骼肌萎缩中的作用及机制。方法烟熏诱导大鼠COPD模型,观察肺及骨骼肌组织的组织形态学变化,利用蛋白质印迹法(Western blotting)及实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)观察骨骼肌细胞内USP-19、肌球蛋白重链(MHC)及丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)基因的表达情况。结果烟熏建立的大鼠COPD模型,大鼠肺组织呈肺气肿改变,烟熏12周时,每高倍镜视野下肌纤维数量增多40%,间接提示骨骼肌发生萎缩;骨骼肌细胞内MHC表达明显下调,与烟熏时间呈负相关;萎缩的骨骼肌细胞内USP-19基因的转录和表达均明显上调,与烟熏时间呈正相关,与MHC表达呈负相关;萎缩的骨骼肌细胞内MAPKs通路磷酸化水平明显增强(P<0.05)。结论 USP-19基因参与COPD模型鼠骨骼肌萎缩的发生,起负性调节作用,此作用可能通过MAPKs通路实现。

饲粮蛋白质水平对肥育猪背最长肌嫩度及骨骼肌特异性蛋白-核转录因子κB信号途径的影响

本试验旨在研究饲粮理想蛋白质水平对背最长肌嫩度及骨骼肌特异性蛋白-核转录因子κB(P94-NFκB)信号途径相关蛋白和钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)mRNA表达量的影响。选择初始重约50 kg的杜洛克×长白×大白三元杂交猪90头,随机分配到3个处理,每个处理3个重复,每个重复10头,公母各占1/2。3个处理分别采用12%、16%、20%理想蛋白质水平的饲粮,饲粮能量水平相同。正试期58 d,结束后屠宰取样,测定肌肉剪切力并利用实时定量PCR法测定猪背最长肌P94、NFκB、核转录因子抑制物(IκB)和CAST mRNA表达量。结果表明:1)饲粮蛋白质水平对背最长肌剪切力、P94、NFκB、IκB和CAST mRNA表达量有显著影响(P<0.05);随饲粮蛋白质水平升高,背最长肌剪切力、IκB和CAST mRNA表达量升高、P94和NFκB mRNA表达量降低。2)背最长肌剪切力与IκB(相关系数为0.513,P<0.05)、CASTmRNA表达量(相关系数为0.816,P<0.01)呈正相关。3)CAST与P94 mRNA表达量呈负相关(相关系数为-0.496,P<0.05),与IκB mRNA表达量呈正相关(相关系数为0.710,P<0.01)。4)P94与NFκB mRNA表达量呈正相关(相关系数为0.550,P<0.05),与IκB mRNA表达量呈负相关(相关系数为-0.518,P<0.05);IκB与NFκB mRNA表达量呈负相关(相关系数为-0.539,P<0.05)。结果提示:饲粮高蛋白质水平提高了猪背最长肌剪切力、CAST和IκBmRNA表达量,降低了肌肉嫩度和P94 mRNA表达量;猪背最长肌P94-NFκB信号途径在肌肉嫩度调控过程中发挥一定作用,但不是主要途径。

补肾健脾方干预去势大鼠骨骼肌caspase-3和caspase-8的表达

背景:骨骼肌与骨质疏松症关系密切,导致其衰退的主要原因是细胞的凋亡,这种凋亡可能是Caspase家族蛋白所介导的。目的:探讨补肾健脾方对去势大鼠骨骼肌caspase-3和caspase-8调控作用。方法:SD大鼠48只等随机分为对照组、模型组、中药组、西药组,后3组大鼠摘除双侧卵巢建立骨质疏松模型,对照组仅切除周围少量脂肪组织。造模2周后,中药组给予补肾健脾方(2.979g/kg)灌胃,西药组给予戊酸雌二醇片(0.104mg/kg)灌胃,模型组和对照组给予蒸馏水灌胃,1次/d。结果与结论:①干预12周后,双能X线骨密度仪测量发现,相比于对照组,模型组大鼠左侧股骨的骨密度值和骨矿含量均明显降低(P<0.01);而中药组和西药组的骨密度值均高于模型组(P<0.05),且2组骨密度值和骨矿含量接近(P>0.05)。②酶标免疫分析显示,与对照组相比,模型组骨骼肌中Caspase-3和Caspase-8表达水平明显上升(P<0.05)。中药能显著降低大鼠骨骼肌中Caspase-3的表达水平(P<0.05),而西药能显著减低Caspase-8表达水平(P<0.05)。③说明补肾健脾方对卵巢切除所致的骨质疏松症有明显的治疗作用,能明显提高骨密度,而且能显著减低Caspase-3的水平,但不能显著减低Caspase-8水平,显示补肾健脾方不是通过死亡受体途径去抑制细胞凋亡的。

盐酸戊乙奎醚对新生大鼠缺氧缺血性脑病模型脑细胞钙离子浓度及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3表达的影响

目的探讨盐酸戊乙奎醚（长托宁）对新生大鼠缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic en-cephalopathy，HIE）模型脑细胞内钙离子浓度[Ca2＋]；及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（cysteinecontaining aspartate—specific proteases-3，Caspase-3）表达的影响。方法新生7日龄健康SD大鼠，共128只，随机分为4组：假手术对照组（Sham组，n=32），HIE模型组（HIE组，n=32），尼莫地平干预组（N组，n=32）及长托宁干预组（P组，n=32）。各组于手术后不同时间点（2h，4h，6h，12h）分批采集脑组织标本。用共聚焦激光显微镜和荧光显微镜分别观察不同组及各组不同时间点大鼠脑皮层细胞[Ca2＋]；和Caspase-3的表达。结果HIE组大鼠脑皮层细胞[Ca2＋]，和Caspase-3的表达，显著高于Sham组（P〈0．01），缺氧缺血后2h，[Ca2＋]i和Caspase-3表达即增加，随着时间延长，[Ca2＋]，和Caspase-3表达逐渐增加，12h时显著高于其他时间点（P〈0．05）。N组与P组的[Ca2＋]；和Caspase-3表达较HIE组明显降低（P〈0．01），但仍高于Sham组（P〈0．01）。N组与P组之间[Ca2＋]；和Caspase-3表达差异无统计学意义（P〉0．05）。N组与P组内12h时[Ca2＋]j和Caspase-3表达与6h比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。结论长托宁可显著缓解缺氧缺血后脑皮层细胞钙超载并减少Caspase-3表达，进而减少脑细胞死亡，起到保护脑细胞的作用。

几丁质酶-3样蛋白1对脂多糖诱导小鼠骨骼肌卫星细胞炎症损伤相关分子表达的影响

目的探讨在脓毒症模型中几丁质酶-3样蛋白1(CHI3L1)介导骨骼肌干细胞损伤的潜在机制。方法用6种浓度的脂多糖(LPS)刺激体外培养的小鼠骨骼肌卫星细胞,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和细胞增殖与毒性试剂盒(CCK-8)筛选出细胞处理最佳浓度。构建CHI3L1过表达和干扰载体转染骨骼肌卫星细胞,采用聚合酶链反应(PCR)、蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)验证转染效率。将细胞按随机数字表法分为空白对照组(不加任何干预的细胞)、模型组(LPS刺激未转染的细胞)、过表达CHI3L1组(LPS刺激转染了CHI3L1过表达质粒的细胞)、过表达CHI3L1对照组(LPS刺激转染了空载质粒的细胞)、干扰CHI3L1组(LPS刺激转染了CHI3L1干扰序列的细胞)、干扰CHI3L1对照组(LPS刺激转染了CHI3L1干扰序列阴性对照的细胞)。采用ELISA检测细胞外天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1(caspase-1)和白细胞介素-1β(IL-1β)的含量;采用Western blotting检测细胞中IL-1β、信号转导和转录激活因子3(STAT3)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白表达水平。结果根据CCK-8和ELISA检测结果筛选出最佳浓度为5 mg/L的LPS进行后续实验,且PCR、Western blotting证实转染有效。与空白对照组比较,模型组细胞外IL-1β、caspase-1含量和细胞中Akt、p-Akt、IL-1β的蛋白表达水平均明显升高〔IL-1β(ng/L):11.22±0.55比8.63±0.63,caspase-1(pmol/L):9.47±0.22比8.65±0.15,Akt/GAPDH:1.36±0.12比1.06±0.15,p-Akt/GAPDH:0.78±0.07比0.09±0.01,IL-1β/GAPDH:1.38±0.12比0.18±0.03,均P<0.05〕。与模型组、过表达CHI3L1对照组比较,过表达CHI3L1组细胞外IL-1β、caspase-1含量和细胞中p-Akt、IL-1β的蛋白表达均明显升高〔IL-1β(ng/L):14.93±0.97比11.22±0.55、9.38±0.40,caspase-1(pmol/L):10.35±0.03比9.47±0.22、8.46±0.24,p-Akt/GAPDH:1.21±0.04比0.78±0.07、0.63±0.04,IL-1β/GAPDH:1.87±0.08比1.38±0.12、1.51±0.17,均P<0.05〕。与模型组、干扰CHI3L1对照组比较,干扰CHI3L1组细胞外IL-1β和caspase-1含量及细胞中p-Akt、IL-1β的蛋白表达均明显降低〔IL-1β(ng/L):8.98±0.73比11.22±0.55、10.44±0.65,caspase-1(pmol/L):7.61±0.63比9.47±0.22、8.37±0.38,p-Akt/GAPDH:0.50±0.04比0.78±0.07、0.94±0.06,IL-1β/GAPDH:0.77±0.02比1.38±0.12、1.13±0.07,均P<0.05〕。结论CHI3L1可能通过caspase-1和IL-1β介导脓毒症模型中小鼠骨骼肌干细胞的损伤;CHI3L1可能参与了调控骨骼肌干细胞中Akt的信号通路,而对STAT3信号通路无明显影响。

胃癌患者Bmi-1、CDH17、胃蛋白酶原检测及与临床病理特征的关系

目的:探究胃癌患者黏膜组织细胞特异性莫洛鼠白血病病毒插入位点1(Bmi-1)、肝肠钙黏连蛋白17(CDH17)及胃蛋白酶原(PGC)表达,并分析这3项指标与患者临床病理特征的关系。方法:随机选取2016年12月—2019年12月确诊并行手术的胃癌患者80例,另选择同期30例胃良性病变患者作为对照组。取手术标本切片,进行免疫组织化学法测定胃黏膜组织Bmi-1、CDH17、PGC及肿瘤标志物[血清糖类抗原50(CA50)、CA199、CA242、CA724及癌胚抗原(CEA)]表达,并采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测所有患者血清肿瘤标志物水平,根据胃癌TNM分期分为Ⅰ~Ⅳ期,对比不同分期各指标差异,并分析Bmi-1、CDH17及PGC与临床病理特征的相关性。结果:胃癌患者Bmi-1、CDH17及PGC表达阳性水平均显著高于胃良性病变患者(P<0.05);随着胃癌患者TNM分期升高,Bmi-1、CDH17及PGC表达阳性率进一步升高,胃癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者Bmi-1、CDH17及PGC阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)。胃癌患者血清及胃黏膜组织中CA50、CA199、CA242、CA724及CEA水平显著高于胃良性病变患者,且随着胃癌患者TNM分期升高,血清CA50、CA199、CA242、CA724及CEA水平进一步升高,各组比较差异有统计学意义(P<0.05)。Spearman等级相关分析结果显示,胃癌组织中Bmi-1、CDH17、PGC、CA50、CA199、CA242、CA724及CEA表达存在呈正相关性(P<0.05)。胃癌患者不同性别、不同年龄、是否远处转移Bmi-1、CDH17、PGC阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05);不同肿瘤分化程度、不同TNM分期、是否淋巴转移、不同肿瘤大小、不同浸润深度Bmi-1、CDH17、PGC阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:在胃癌的发生发展过程中,Bmi-1、CDH17、PGC表达明显提高,并与胃癌患者的临床病理特征存在相关性,检测Bmi-1、CDH17、PGC表达对于反映胃癌生物学行为具有重要意义。

RNAi沉默Sp3基因对裸鼠人肝癌种植瘤细胞侵袭能力的影响

目的:构建裸鼠人肝癌种植瘤模型,观察沉默特异性蛋白3(specificity protein 3,Sp3)对裸鼠人肝癌种植瘤侵袭能力的影响,并探讨其机制.方法:将Sp3 shRNA转染人肝癌HepG2细胞,并设无关序列阴性组及空白组为对照,建立3组裸鼠人肝癌种植瘤模型.观察裸鼠肿瘤的成瘤率,瘤体进行HE染色观察其病理学改变,采用Real-time PCR及免疫组织化学检测瘤组织中Sp3、β-连接素(β-catenin)、E-钙黏附蛋白(E-cadherin)及基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)mRNA和蛋白的表达情况.结果:实验组的成瘤率明显低于其他两组(60%vs 100%,100%);HE观察实验组肿瘤细胞侵袭能力明显降低.荧光定量PCR检测结果显示,种植瘤中实验组的Sp3、β-catenin及MMP-9 mRNA相对表达量明显低于空白组及阴性组,差异有统计学意义(F=29.692,P=0.001;F=21.894,P=0.002;F=109.414,P<0.001);实验组瘤体中E-cadherin mRNA的相对表达量高于其他两组(F=66.983,P<0.001).免疫组织化学结果显示,实验组Sp3蛋白表达为30±5.69、β-catenin蛋白表达为28±5.13、MMP-9蛋白表达为97±10.41均低于空白组及阴性组;E-cadherin蛋白表达为132±4.36明显高于其他两组,差异有统计学意义(P=0.000).结论:Sp3可通过上调β-catenin及其下游基因MMP-9表达,同时下调E-cadherin的表达,增强人肝癌细胞的侵袭能力.

大电导钙依赖性钾通道参与脓毒症炎症应答的机制研究

目的探讨大电导钙依赖性钾通道(BKCa)参与脓毒症发病的机制。方法收集脓毒症患者(28例)、普通感染者(25例)和健康体检者(25例)血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定BKCa水平;并分析脓毒症患者血清BKCa水平与急性生理学与慢性健康状况评分Ⅱ(APACHEⅡ)的相关性。培养RAW 264.7细胞,用脂多糖(LPS)刺激,部分实验以尼日尼亚菌素(Nigericin)作为第二刺激信号构建脓毒症细胞模型;采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)、蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)测定不同浓度LPS(0、50、100、1000μg/L)刺激后细胞BKCa的mRNA和蛋白表达。RAW 264.7细胞转染BKCa的小干扰RNA(siRNA-BKCa),用Western blotting测定细胞天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1前体(pro-caspase-1)、白细胞介素-1β前体(pro-IL-1β),细胞培养液中caspase-1 p20、IL-1βp17,以及NOD样受体蛋白3(NLRP3)、核转录因子-κB(NF-κB)水平。碘化丙啶(PI)染色后荧光显微镜下观察凋亡情况,测定乳酸脱氢酶(LDH)释放率,Western blotting测定细胞凋亡蛋白Gasdermin D(GSDMD)表达以评估沉默BKCa对细胞焦亡的影响。结果脓毒症患者血清BKCa明显高于普通感染者和健康体检者(ng/L:165.2±25.9比102.5±25.9、98.8±20.0,均P<0.05),且脓毒症患者血清BKCa水平与APACHEⅡ评分呈显著正相关(r=0.453,P=0.013)。用LPS构建脓毒症细胞模型,显示LPS呈浓度依赖地促进BKCα的mRNA和蛋白表达,1000μg/L刺激后细胞BKCa的mRNA和蛋白表达水平均较空白组(0μg/L)明显增加〔BKCa mRNA(2^(-ΔΔCt)):3.00±0.36比1.00±0.16,BKCa/β-actin:1.30±0.16比0.37±0.09,均P<0.05〕。与对照组比较,模型组细胞caspase-1 p20/pro-caspase-1比值、IL-1βp17/pro-IL-1β比值均明显升高(caspase-1 p20/pro-caspase-1比值:0.83±0.12比0.27±0.05,IL-1βp17/pro-IL-1β比值:0.77±0.12比0.23±0.12,均P<0.05);但转染siRNA-BKCa后二者均较模型组明显下降(caspase-1 p20/pro-caspase-1比值:0.23±0.12比0.83±0.12,IL-1βp17/pro-IL-1β比值:0.13±0.05比0.77±0.12,均P<0.05)。与对照组比较,镜下观察模型组凋亡细胞明显增多,LDH释放率、GSDMD表达明显增加〔LDH释放率:(30.60±8.40)%比(15.20±7.10)%,GSDMD-N/GSDMD-FL:2.10±0.16比1.00±0.16,均P<0.05〕;但转染siRNA-BKCa后上述指标均较模型组明显下降〔LDH释放率:(15.60±7.30)%比(30.60±8.40)%,GSDMD-N/GSDMD-FL:1.13±0.17比2.10±0.16,均P<0.05〕。脓毒症细胞NLRP3的mRNA和蛋白表达水平均较对照组明显增加〔NLRP3 mRNA(2^(-ΔΔCt)):2.06±0.17比1.00±0.24,NLRP3/GAPDH:0.46±0.05比0.15±0.04,均P<0.05〕;但转染siRNA-BKCa后NLRP3表达较模型组明显下降〔NLRP3 mRNA(2^(-ΔΔCt)):1.57±0.09比2.06±0.17,NLRP3/GAPDH:0.19±0.02比0.46±0.05,均P<0.05〕。与对照组比较,脓毒症细胞NF-κB p65核转移明显增加(NF-κB p65/Histone:0.73±0.12比0.23±0.09,P<0.05);而转染siRNA-BKCa后细胞核中NF-κB p65表达明显下降(NF-κB p65/Histone:0.20±0.03比0.73±0.12,P<0.05)。结论BKCa参与脓毒症发病,其可能机制是激活NF-κB/NLRP3/caspase-1信号通路诱导炎症因子生成和细胞焦亡。

复方鹿茸健骨胶囊联合唑来膦酸治疗骨质疏松症的临床研究

目的探讨复方鹿茸健骨胶囊联合唑来膦酸注射液治疗骨质疏松症的临床疗效。方法选取唐山市人民医院2020年8月—2023年2月收治的132例骨质疏松症患者,根据计算机随机排列法将患者分为对照组和治疗组,各66例。对照组患者静脉滴注唑来膦酸注射液,1支/次,1次/4周。治疗组在对照组基础上口服复方鹿茸健骨胶囊,5粒/次,3次/d。两组患者连续治疗6个月。比较两组的临床疗效、疼痛程度、骨密度、血清骨代谢指标和血清炎症反应指标。结果治疗后,治疗组的总有效率(92.42%)比对照组高(80.30%),组间差异显著(P<0.05)。治疗后,两组的数字疼痛强度量表(NRS)评分均低于治疗前(P<0.05),且治疗组的NRS评分低于对照组(P<0.05)。治疗后,两组粗隆、股骨颈、腰椎的骨密度比治疗前大(P<0.05),且治疗组粗隆、股骨颈、腰椎的骨密度比对照组更大(P<0.05)。治疗后,两组的血清骨钙素(BGP)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、白细胞介素-17(IL-17)水平显著降低,血清骨特异性碱性磷酸酶(BALP)、骨保护素(OPG)水平显著升高(P<0.05);治疗组的血清BGP、MMP-9、IL-17水平低于对照组,血清BALP、OPG水平高于对照组(P<0.05)。结论复方鹿茸健骨胶囊联合唑来膦酸注射液可显著提高骨质疏松症的疗效,进一步提高骨密度,调节骨代谢水平,降低炎症反应。

双微导管技术对急性颅内宽颈动脉瘤的治疗效果

目的探讨双微导管技术对急性颅内宽颈动脉瘤的治疗效果及对血清基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、神经元特异性醇化酶(NSE)、中枢神经特异性蛋白β(S100β)水平的影响。方法选择2020年1月至2023年3月安徽医科大学附属宿州医院收治的80例急性颅内宽颈动脉瘤患者进行前瞻性研究,按照随机数字表法分为观察组与对照组,各40例。对照组患者采用支架辅助弹簧圈介入栓塞术治疗,观察组患者采用双微导管技术血管内介入栓塞术治疗。比较两组围术期情况,血清MMP-9、NSE、S100β的变化,并比较短期预后、美国国立卫生院卒中量表(NIHSS)评分、Barthel指数(BI)评分的变化及并发症发生率。结果观察组手术时间、住院时间均短于对照组,差异有统计学意义(均P<0.05);术后7 d时,观察组血清MMP-9、NSE、S100β水平均低于对照组,差异有统计学意义(均P<0.05);观察组短期预后良好率为55.00%(22/40),明显高于对照组的32.50%(13/40),差异有统计学意义(均P<0.05);观察组术后1个月时NIHSS评分低于对照组,BI评分高于对照组,差异有统计学意义(均P<0.05);两组术后并发症总发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论双微导管技术对急性颅内宽颈动脉瘤的治疗效果明显,可减少术后血清MMP-9、NSE、S100β水平升高幅度,促进术后恢复,值得临床推广。