骨髓基质干细胞与聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸/聚乙二醇体外复合培养的实验研究

目的探讨骨髓基质干细胞(marrowstromalstemcells,MSCs)与聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸/聚乙二醇[poly(lacticacid/glycolicacid/asparagicacid-co-polyethyleneglycol),PLGA-ASP-PEG]的生物相容性,为构建组织工程骨进行骨缺损修复提供理论基础,以及为组织工程支架材料的优化提供实验依据。方法本体开环共聚法合成PLGA-ASP-PEG三嵌段共聚物。取4周龄新西兰大白兔骨髓,体外分离培养MSCs。将第3代MSCs以1.0×106/ml接种到PLGA-ASP-PEG材料上,测定细胞黏附力和黏附率;扫描电镜观察细胞的形态学特征;MTT法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞周期、增殖指数、DNA指数及凋亡;通过考马斯亮蓝测定法和3H-脯氨酸掺入实验观察细胞的蛋白合成和胶原合成情况。以PLGA支架材料作为对照。结果MSCs在PLGA-ASP-PEG支架材料上贴附、生长良好,其黏附、增殖和蛋白、胶原合成能力均显著高于PLGA组(P<0.05),细胞凋亡率显著低于PLGA组(P<0.05)。DNA指数显示两组细胞均为正常的二倍体细胞。结论PLGA-ASP-PEG的生物学性能与PLGA相比得到显著改善和提高,可作为MSCs的理想载体构建组织工程骨进行骨缺损修复研究。

5-氮杂胞苷对骨髓间充质干细胞向肌细胞增殖及分化的影响

目的:探讨在不同浓度5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导间充质干细胞(MSCs)分化为成肌细胞过程中, 其对干细胞增殖及分化的影响。方法:分离纯化鉴定4周龄Wistar大鼠骨髓MSCs,以不同浓度5-Aza作用,用四唑盐(MTT)法测定细胞生长活力,观察细胞形态变化,通过RT-PCR及电泳测定诱导后大鼠的MSCs中骨骼肌肌动蛋白的表达。结果:0和1 μmol·L-1 5-Aza对细胞增殖无明显影响;随着5-Aza浓度的增高,MSCs 的增殖逐渐减弱;20～30 μmol·L-1 5-Aza对细胞有毒性作用,影响其增殖。3和6 μmol·L-1 5-Aza,MSCs有骨骼肌肌动蛋白的表达;9和12 μmol·L-1 5-Aza,MSCs有骨骼肌肌动蛋白的表达,该浓度作用9 d后有部分细胞体明显增粗,12 d有肌管样细胞出现。结论:5-Aza影响干细胞分化,调控基因的表达及调控MSCs向肌细胞定向分化为肌管样细胞的过程。

非接触共培养法诱导人骨髓间充质干细胞向内皮细胞的分化

背景:最近研究表明将乳鼠心肌细胞和骨髓间充质干细胞非接触共培养后,可成功将骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌细胞。目的:尝试通过非接触共培养方式,利用人脐静脉内皮细胞诱导人骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化。设计、时间及地点:细胞组织工程学体外实验,于2007-01/07在广东省人民医院医学研究中心完成。材料:骨髓标本来源于11例无血液系统疾病的先天性心脏病患儿,征得家属同意后在心脏矫治手术中从胸骨柄穿刺获取少量骨髓用于实验。足月顺产健康新生儿脐带由中山大学附属一院产科协助取得。新鲜牛颈静脉由广东大沥菜牛屠宰厂提供。方法:取骨髓标本,以密度梯度离心法分离纯化人骨髓间充质干细胞,并在体外扩增培养;以酶消化法自新生儿脐带获取人脐静脉内皮细胞。采用具有半透膜的细胞培养池结合6孔板的方式进行非接触共培养诱导,将人脐静脉内皮细胞铺于培养池内,第3代骨髓间充质干细胞以1×105/孔铺在培养池外的6孔板内,两种细胞的初始比例为1:5,加入含体积分数为0.1胎牛血清的低糖DMEM培养液,培养14d。以骨髓间充质干细胞和骨髓间充质干细胞共培养作为对照组。诱导后的内皮样细胞扩增培养,种植在脱细胞牛颈静脉血管支架上。主要观察指标:诱导后细胞形态变化,免疫细胞化学染色检测诱导后内皮样细胞表面相关抗原,扫描电镜观察内皮样细胞在血管支架上的生长黏附情况。结果:诱导后的内皮样细胞形态均一,呈铺路石状排列,扩增迅速,表达内皮细胞特有的表面标志CD31和vWF,阳性率均>99%,可以在脱细胞牛颈静脉血管支架表面形成连续的单细胞层。结论:非接触共培养方式下,人脐静脉内皮细胞可成功诱导人骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化,并能够在脱细胞牛静脉血管支架上黏附生长。

骨髓间充质干细胞体外培养分化为肌原性细胞的实验研究

目的 研究骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为心肌细胞的可行性。方法 由新西兰大白兔胸骨获取骨髓间充质干细胞 ,培养传代后用 5 -氮杂胞苷诱导 2 4h ,免疫组化检测诱导后细胞的变化。结果 5 -氮杂胞苷诱导后的细胞经免疫组化检测可见细胞被抗肌红蛋白抗体着染显色。结论 骨髓间充质干细胞可在体外经 5 -氮杂胞苷诱导后转化为肌原性细胞。

大鼠骨髓间质干细胞静脉移植在脊髓损伤中的定向迁移

目的观察大鼠骨髓间质干细胞(ratbonemarrowstromalcells,rMSCs)静脉移植在体内的定向迁移。方法分离培养rMSCs,流式细胞术检测其表面标志,运用改良Allen法制备大鼠T10脊髓损伤模型,随机分为假手术组、对照组、rMSCs静脉移植组。假手术组、rMSCs静脉移植组同时于大鼠损伤后72小时经尾静脉移植溴脱氧尿苷(BrdU)标记MSCs。免疫组化技术检测rMSCs在体内迁移、存活以及分化情况。结果rMSCs体外分离培养扩增5代,细胞数可达1～2×1011个,具有多态性和贴壁生长特性,流式细胞术检测CD34、CD45阴性,CD29、CD90表达阳性。移植的rMSCs在宿主损伤脊髓中聚集并存活,3～5W后即有部分移植细胞表达神经元特异性烯醇化酶(neuronspecificenolase,NSE)、神经丝蛋白(neurofilament,NF)、微管相关蛋白(microtubuleassociatedprotein2,MAP2)。结论rMSCs体外扩增迅速,具有干细胞特性,经静脉移植在宿主体内可向损伤区脊髓聚集存活分化。

自体骨髓血干细胞移植治疗术治疗糖尿病足2例护理体会

糖尿病患者由于合并神经病变及各种不同程度末梢血管病变而导致下肢感染、溃疡形成和深部组织的破坏,从而形成糖尿病足[1].导致糖尿病截肢的首位原因是足溃疡的不愈合及其并发症.2004年11月-2005年3月,我科收治2例糖尿病足患者,在控制血糖、营养神经、改善微循环及局部清创换药的基础上,通过自体骨髓血干细胞移植治疗术治疗糖尿病足,取得满意结果,现将其中的护理体会报道如下:

黄芪和三七对下肢缺血患者骨髓间充质干细胞体外分化的影响(英文)

背景：目前临床观察已经证实中药黄芪、三七能够改善下肢缺血症状，假设这种治疗作用与其促进骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化有关。目的：验证黄芪、三七是否能够有效促进骨髓间充质干细胞增殖并向血管内皮细胞分化。设计、时间及地点：骨髓间充质干细胞的体外分化实验，于2005—04／06在北京中医药大学附属东直门医院教育部重点实验室完成。材料：抽取北京中医药大学东商门医院收治的下肢血管缺血性病变患者23例骨髓血，密度梯度法分离骨髓单个核细胞，即骨髓间充质干细胞。相当于生药材2g／mL的黄芪注射液为成都地奥九泓制药厂产品，主要成分为三七总皂苷的血塞通粉针剂黑龙江珍宝岛制药有限公司产品，CD34抗体为美国BD公司产品，FACS Calibur流式细胞仪为美国BD公司产品。方法：将骨髓间充质干细胞与3mL低、中、高剂量含生药4，12，36g/L的黄芪注射液，3mL低、中、高剂量含三七总皂苷50，100，200mg／L血塞通混悬液进行共培养，并设未加入药物的单纯培养干细胞为空白对照组；隔日换液一次，连续培养3周。主要观察指标：培养3周后，倒置相差显微镜下观察细胞形态；流式细胞仪检测CD34^＋细胞百分比。结果：①骨髓间充质干细胞培养3周后贴壁细胞大部分呈梭形，束状排列，具有内皮细胞形态和特性。②与空白对照组比较，黄芪低、中剂量组和三七中、高剂量组CD34^＋细胞百分比显著增加（P〈0．05～0．01）。结论：黄芪、三七有促进骨髓间充质干细胞增殖并向血管内皮细胞分化的作用，此作用呈剂量依赖性。

大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化及神经蛋白的动态表达

背景:现阶段骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞的方法并不统一。目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞体外向神经样细胞诱导分化的条件,及其定向分化过程中神经蛋白的动态表达。设计、时间及地点:细胞形态学观察及蛋白分子水平检测,于2006-09/2007-01在苏州大学生命科学学院完成。材料:清洁级SD大鼠2只。胎牛血清为杭州四季青产品,成纤维生长因子、丁羟基茴香醚为Sigma公司产品,二甲基亚砜为Amresco产品。方法:Percoll法体外分离培养、扩增纯化大鼠骨髓间充质干细胞,调整细胞密度为5×107L-1。设立2组,诱导组用含10%胎牛血清和10μg/L成纤维生长因子的L-DMEM培养基预诱导24h后,再以含2%二甲基亚砜和200μmol/L丁羟基茴香醚的L-DMEM无血清培养基诱导1,3,5h。对照组始终用含10%胎牛血清的L-DMEM进行培养。主要观察指标:细胞形态学变化,免疫荧光染色鉴定神经细胞表型。结果:预诱导24h,胞体由原来的长梭形变成多角形或不规则形,伸出多个短棒状突起,可见2～3个核仁,细胞间漩涡状生长趋势消失,排列无规律;诱导1～3h,细胞逐渐变圆,胞质收缩明显,折光性增强,双级或多极的突起互相连接呈网状;诱导5h,突起出现一、二级分支。诱导1h后部分细胞表达神经前体细胞表面抗原巢蛋白;3h后巢蛋白达高峰,同时表达成熟神经元标志物神经元特异性烯醇化酶和微管蛋白;5h后巢蛋白表达下降,神经元特异性烯醇化酶和微管蛋白达高峰。对照组细胞形态无明显变化,巢蛋白表达为阴性。结论:在添加化学诱导剂之前先使用成纤维生长因子进行预诱导,能促进骨髓间充质干细胞向神经前体细胞和神经元转化,且在诱导分化过程中神经蛋白分子的表达顺序与神经细胞发育过程一致。

腺病毒介导TGF-β_1及BMP-7基因共表达感染骨髓基质干细胞修复兔关节软骨缺损

目的探讨腺病毒介导转化生长因子β1(TGF-β1)及骨形成蛋白7(BMP-7)基因共表达感染对骨髓基质干细胞(MSCs)增殖和定向分化的影响,观察其构建组织工程化软骨对关节软骨缺损的修复质量和疗效。方法以腺病毒AdEasy为基因转移载体,制备携带TGF-β1和BMP-7基因的高滴度腺病毒感染兔MSCs,利用外源性基因编码的生长因子诱导其表达软骨细胞表型,通过免疫细胞化学、原位杂交、RT-PCR及己糖醛酸水平检测等方法鉴定。再将其与骨基质明胶(BMG)支架相复合体外构建组织工程化软骨,移植修复同种异体兔关节软骨缺损并进行形态学和组织学观察及修复结果分析。结果腺病毒感染MSCs后免疫细胞化学染色和RT-PCR可检测出外源基因及其编码蛋白的表达,通过原位杂交可检测出Ⅱ型胶原蛋白基因表达,细胞培养液中己糖醛酸水平明显升高。将其复合于骨基质明胶上,经组织染色和电镜观察可见前体软骨细胞贴附于BMG表面和孔隙内大量增殖,在体移植修复实验组新生组织为类透明软骨,修复效果明显优于各对照组。结论MSCs经携带TGF-β1和BMP-7基因的腺病毒感染后,体外能向软骨细胞作定向分化,可用于制备组织工程化软骨,使提高关节软骨缺损的修复质量成为可能。

胎牛血清-Fe_2O_3标记骨髓间充质干细胞的实验研究

目的为骨髓间充质干细胞(BMSCs)在体示踪实验提供一种新型、方便、快捷、可靠的标记方法。方法体外实验部分,Fe2O3分析纯饱和溶液与新鲜胎牛血清按一定比例充分混匀,再与豚鼠BMSCs孵育8h即可标记;体内实验部分,将胎牛血清-Fe2O3标记的豚鼠BMSCs注射到SD大鼠胸腺内,并将大鼠胸腺切片染色观察。结果胎牛血清-Fe2O3标记BMSCs的标记率达到100%,主要标记部位在细胞浆;胎牛血清-Fe2O3标记的BMSCs仍然具有向胸腺被膜细胞、胸腺细胞及血管壁细胞等细胞分化的功能,即对细胞的生存、生长、分化等生物学特性没有影响。结论胎牛血清-Fe2O3可以标记BMSCs,且对BMSCs的生物学特性没有影响。

壮骨颗粒含药血清对兔骨髓基质干细胞体外增殖及分化影响

目的:研究壮骨颗粒含药血清对骨髓基质干细胞体外成骨活性的影响。方法:采用体外细胞培养技术,用壮骨颗粒对细胞进行体外诱导培养建立实验组,并设置空白血清对照组,进行MTT、免疫组织化学染色及ALP测定,观察壮骨颗粒对骨髓基质细胞的诱导作用。结果:在促细胞增殖方面,实验组作用最显著(P<0.01),在第3天开始增殖,第6天达到平台期,而对照组对数增殖期明显延长(P<0.01);在促细胞分化方面,常规形态学观察,壮骨颗粒组诱导的细胞在形态上类似于成骨细胞,免疫组化染色提示诱导细胞具有骨细胞表型。结论:壮骨颗粒可促进细胞增殖,并诱导骨髓基质细胞向成骨细胞分化。

无定形磷酸钙负载rhBMP-2纳米缓释体的制备及细胞毒性实验

[目的]制备无定形磷酸钙(ACP)负载重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2/ACP)纳米缓释体并观察其细胞毒性,为进一步体内植入提供实验依据。[方法]采用湿化学法合成rhBMP-2/ACP纳米缓释体;兔间充质干细胞(BMSCs)与rhBMP-2/ACP纳米缓释体进行体外复合培养,观察细胞在材料表面的黏附、增殖及功能表达,检测材料的细胞毒性。[结果]材料浸提液对兔BMSCs的生长无影响,其细胞相对增殖率在100.2%～102.5%之间,细胞毒性评级为0级;BMSCs于复合材料表面的黏附、生长速度、形态与对照组无明显差别。[结论]rhBMP-2/ACP纳米缓释体无细胞毒性,复合培养不影响BMSCs的正常生理功能,细胞相容性良好。

RGD多肽表面修饰对HA-TCP生物陶瓷细胞相容性的影响

目的:了解精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)多肽表面修饰对羟基磷灰石-磷酸三钙(hydroxyapatite-tricalcium phosphate,HA-TCP)细胞相容性的影响。方法:以骨髓基质干细胞(marrow stromal stem cells,MSCs)复合RGD多肽表面修饰的HA-TCP或单纯材料培养制备组织工程骨,用倒置相差显微镜和扫描电镜观察MSCs的粘附和生长情况、检测细胞活力和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、流式细胞仪分析细胞周期。结果:MSCs在材料表面和孔隙内均可粘附和生长,粘附于RGD多肽修饰HA-TCP的细胞活力和ALP活性明显高于未经RGD多肽修饰组(P<0.01,P<0.05)。各组细胞周期未见明显变化,未见异倍体细胞。结论:RGD多肽表面修饰对HA-TCP材料的细胞相容性有明显的优化作用。

不同传代倍数成人间充质干细胞成骨分化能力的研究

目的:观察不同传代倍数成人骨髓间充质干细胞(MSC)定向诱导分化为成骨细胞的能力,为自体MSC修复骨组织损伤的临床应用提供部分参数。方法:采用全髓直接接种法分离培养胸科手术取下肋骨骨髓,贴壁细胞达90%以上融合时消化传代。传代细胞部分以1×106/ml的细胞密度接种于含100ml/L胎牛血消(FBS)的L-DMEM的培养基中继续培养,传代;部分在培养基中添加成骨诱导剂地塞米松,β-甘油磷酸钠及抗坏血酸向成骨细胞诱导分化。如此连续传10代。结果:5代以内成人MSC成骨分化能力无显著差异(P>0.05),以第3代最强,第6代后MSC成骨分化能力逐渐减弱。结论:不同代次的MSC诱导分化为成骨细胞的能力不同,6代以后明显减弱。做为组织工程的种子细胞,成人MSC体外培养不宜超过5代。

晚期糖基化终末产物对小鼠骨髓干细胞向血管内皮细胞分化的影响

观察晚期糖基化终末产物（AGEs）对骨髓干细胞（BMSC）向内皮细胞分化的影响。结果发现，20μg／ml AGEs对BMSC分化的影响不明显，100μg/ml AGEs使BMSC分化能力明显下降，血管内皮生长因子受体2阳性细胞计数和百分数均明显降低。

真性红细胞增多症患者骨髓CD_(34)阳性细胞凋亡及增殖特征研究

目的 了解真性红细胞增多症 (PV)患者骨髓CD34 阳性细胞的凋亡、增殖情况。方法 应用双色流式细胞仪检测 2 0例PV患者及 10例原发性血小板增多症 (ET)患者和 12名正常人骨髓CD34 阳性细胞AnnexinⅤ以及细胞增殖相关抗原Ki6 7的表达情况并分析其与PV临床表现的相关性。结果 PVCD34 阳性细胞AnnexinⅤ表达率为 (15 .96± 1.4 5 ) % ,ET为 (15 .5 3± 1.76 ) % ,明显低于正常对照组的 (2 3.6 1± 3.89) % (P <0 .0 5 ) ;CD34 阳性细胞Ki6 7表达率PV为 (4 8.79± 11.6 8) % ,ET为 (4 9.6 0±9.98) % ,明显高于正常对照组的 (33.87± 6 .82 ) % (P <0 .0 1) ;凋亡增殖比PV为 0 .33± 0 .10 ,ET为 0 .32± 0 .0 2 ,明显低于正常对照组的 0 .72± 0 .11(P <0 .0 1) ;CD34 阳性细胞凋亡与血红蛋白、白细胞计数、内源性红系集落呈负相关 (分别r=- 0 .4 81,P =0 .0 37;r=- 0 .5 38,P =0 .0 2 6 ;r=- 0 .6 32 ,P =0 5 0 )。凋亡增殖比与血红蛋白、白细胞计数呈负相关 (分别r=- 0 .5 37,P =0 .0 18;r=- 0 .6 6 7,P =0 0 0 3)。结论 PV患者骨髓CD34 阳性细胞有低凋亡及高增殖特点 ,低凋亡与疾病严重度相关。

灌注式生物反应器中流体剪切力对大段组织工程化骨构建的作用

目的结合流体力学模型研究灌注式生物反应器中大段组织工程化骨的构建与多孔支架内流体剪切力的关系。方法利用灌注式生物反应器对复合骨髓基质干细胞的多孔磷酸三钙支架进行灌注培养。培养基的黏度分别为1.12mPa.s,2.23mPa.s及3.35mPa.s。通过细胞增殖、成骨分化及组织形态学评价组织工程化骨的构建,建立流体力学模型,求解支架内的流体剪切力。结果培养基黏度2.23mPa.s组,细胞增殖高于其他组。培养基黏度2.23mPa.s及3.35mPa.s组第28d的碱性磷酸酶活性及第7d后的骨钙素分泌高于1.12mPa.s组。培养基黏度越高,骨桥蛋白的分泌高峰出现越早。28d后,黏度3.35mPa.s组的钙化基质最多。流体力学模型分析,培养基黏度1.12mPa.s,2.23mPa.s及3.35mPa.s组中,支架内的平均流体剪切力分别为5mPa,11mPa和15mPa。结论在利用复合人骨髓基质干细胞的多孔磷酸三钙构建大段组织工程化骨的过程中,15mPa的流体剪切力最有利于组织工程化骨的构建。

成人股骨头坏死的治疗进展

股骨头坏死(ONFH)是一种进展性和致残性疾病,保存自身股骨头是临床治疗所追求的最理想目标,早中期的治疗方案主要采用非手术疗法和保髋的姑息性手术,目前为止还没有一种治疗方法能达到理想的治疗效果。近年来,骨髓间充质干细胞(MSCs)移植治疗ONFH是目前研究热点之一,有望成为一种有效的治疗方法,晚期行人工髋关节置换术是唯一的和最佳的选择。因此,早期诊断,采用综合性治疗方案保全自身髋关节是治疗本病的主要方向。

大鼠骨髓间充质干细胞培养4周膜电流研究

目的:研究未经诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)培养4周(4～6代)膜电流特性,为移植细胞的选取和细胞移植后心肌电生理研究奠定基础。方法:按文献方法获得和培养MSCs至第4周,利用全细胞膜片钳技术对培养4周的MSCs膜电流进行检测,以各种钾钠钙通道阻滞剂对电流成分进行分析鉴定。结果:本实验成功封接并有电流表达细胞共39例,所有检测到的电流均以相应阻滞剂证实。共有4种钾电流表达即缓慢激活延迟整流钾电流、瞬时外向钾电流、超速激活延迟整流钾电流和内向整流钾电流(Ikir),3种外向钾电流在+60mV时电流峰值均值分别为(0.3894±0.1230)nA、(0.4135±0.1029)nA、(0.2570±0.1135)nA;Ikir在-120mV时电流大小为(0.9613±0.1484)nA;此外在极少数MSCs上检测到河豚毒素敏感的内向钠电流(ITTX.Na),未检测到内向钙电流。结论:培养4周后的MSCs存在钾钠电流的复合表达,从电生理角度看,MSCs有分化成功能性心肌样细胞的离子基础,其可作为体内移植较理想细胞选择。

电离辐射致股骨头坏死早期病理特点和机制的研究

目的观察单次大剂量射线引起大鼠股骨头坏死的早期病理改变，为放射性骨坏死特别是放射性股骨头坏死的早期诊断和防治研究提供依据。方法^137Csγ射线（30Gy）体外局部单侧单次照射大鼠股骨头，受照后2、6和12周取双侧股骨头HE染色，光镜观察病理改变；照后2周骨髓间充质干质细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）分离培养，观察BMSCs增殖和集落形成能力；照后12周血管内灌注Microfill造影剂，采用微CT对股骨头毛细血管网进行三维重建和分析。结果^137Csγ射线局部照射后，受照侧股骨头软骨柱紊乱，骨细胞核皱缩、数量减少、空骨陷窝增多、骨小梁面积减少（P〈0.05）；受照侧股骨头毛细血管密度由未照侧的12.3％降至6.65％（P〈0.05）；BMSCs生长缓慢，集落形成率为10％，较对照组（21％）明显下降（P〈0.05）。结论30Gy单次局部照射后骨组织病理改变主要表现为空骨陷窝增加，照射后6周空骨陷窝率达30％可作为放射性股骨头坏死早期预诊断的指标之一。辐射致股骨头损伤甚至坏死除了射线对骨组织的损伤外，还与射线对骨髓BMSCs和毛细血管的损伤有关。