小分子药物TD-198946促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:小分子药物TD-198946是一种能诱导干细胞形成软骨的高效软骨生成剂,但目前尚不清楚其对成骨分化的作用。目的:探讨小分子药物TD-198946促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的效果及其作用机制。方法:提取SD大鼠骨髓间充质干细胞,利用CCK-8法评估不同浓度TD-198946对骨髓间充质干细胞增殖的影响,确定TD-198946的最佳使用浓度;然后加入最适浓度TD-198946和成骨分化培养基对骨髓间充质干细胞进行成骨诱导;成骨诱导第3天用qRT-PCR检测碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨桥蛋白、骨钙蛋白、Ⅰ型胶原基因表达;成骨诱导第7天进行碱性磷酸酶染色,Western blot检测Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K蛋白表达;成骨诱导第21天进行茜素红染色。结果与结论:①CCK-8实验结果显示,100 nmol/L TD-198946能促进骨髓间充质干细胞增殖;②碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果显示,TD-198946能促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化;③qRT-PCR结果显示,TD-198946可促进成骨相关基因碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨桥蛋白、骨钙蛋白、Ⅰ型胶原的表达;④Western blot结果显示,TD-198946可促进Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原以及p-PI3K、p-AKT蛋白表达。结果表明,小分子药物TD-198946可能通过激活PI3K/AKT信号通路,诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化。

补骨脂素对环磷酰胺抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的恢复作用

背景:补骨脂素具有很强的抗骨质疏松活性,可能对化疗导致的骨质疏松具有恢复作用。目的:探讨补骨脂素对环磷酰胺抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的恢复作用及机制。方法:分离培养C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,以MTT法检测补骨脂素对骨髓间充质干细胞活力的影响,以成骨诱导结合碱性磷酸酶染色确定补骨脂素对环磷酰胺抑制骨髓间充质干细胞成骨分化恢复作用的最佳剂量。采用RT-qPCR法检测补骨脂素干预不同时间点成骨分化标志基因Runx2、ALP、Osteocalcin、骨保护素及Wnt/β-catenin信号通路相关基因Wnt1、Wnt4、Wnt10b、β-catenin、c-MYC的mRNA表达;采用Western blot法检测补骨脂素干预不同时间点成骨特异性转录因子Runx2及Wnt/β-catenin信号通路相关基因Activeβ-catenin、DKK1、c-MYC、Cyclin D1的蛋白表达。结果与结论:(1)不同浓度补骨脂素对骨髓间充质干细胞活力没有显著影响;200μmol/L补骨脂素干预后对环磷酰胺诱导骨髓间充质干细胞成骨分化抑制的恢复作用最佳;(2)补骨脂素可以逆转环磷酰胺条件培养基导致的骨髓间充质干细胞成骨标志基因Runx2、ALP、Osteocalcin、骨保护素mRNA表达和Runx2蛋白表达的降低;(3)补骨脂素可以逆转环磷酰胺条件培养基导致的骨髓间充质干细胞Wnt/β-catenin通路相关基因Wnt4、β-catenin、c-MYC mRNA表达和Activeβ-catenin、c-MYC、Cyclin D1蛋白表达的降低以及DKK1蛋白表达的升高;(4)结果表明,环磷酰胺能抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化,补骨脂素对其具有恢复作用,且200μmol/L补骨脂素干预效果最佳,而这种保护作用可能与补骨脂素激活Wnt4/β-catenin信号通路有关。

Osteonectin促进骨髓来源间充质干细胞成骨分化的机制及其与青少年特发性脊柱侧凸的相关性研究

目的 探究Osteonectin在促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的分子机制,以及Osteonectin在青少年特发性脊柱侧凸(AIS)中的作用。方法 将2020年5月—2022年5月就诊的20例AIS及健康体检20例分别作为AIS组和健康组。使用qRT-PCR技术测定2组BMSCs中Osteonectin、BMP2以及Wnt/β-catenin信号通路相关基因(Tcf7、Lef1)和成骨分化相关基因(Runx2、Osteocalcin)的表达水平。通过X线检测AIS患者的Cobb角度,并分析上述基因表达水平与Cobb角度的相关性。在BMSCs中,加入Osteonectin和BMP2抑制剂Noggin,并分为对照组、Osteonectin组和Osteonectin+Noggin组。通过qRT-PCR检测BMSCs中BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平。采用ChIP-qPCR检测β-catenin在Runx2和Osteocalcin基因转录起始位(TSS)的富集水平。结果 与健康组比较,AIS组BMSCs中Osteonectin、BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平均降低(P<0.05);Osteonectin、BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平与AIS患者Cobb角度呈负相关(r=-0.466 3、-0.369 1、-0.272 7、-0.543 4、-0.606 5、-0.343 3,P<0.05,P<0.01)。与对照组比较,Osteonectin组BMSCs中BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平升高,且β-catenin在Runx2和Osteocalcin mRNA TSS富集水平增加(P<0.05)。相比Osteonectin组,Osteonectin+Noggin组BMSCs中Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平降低,β-catenin在Runx2和Osteocalcin mRNA TSS富集水平降低(P<0.05)。结论 在AIS患者中,BMSCs中Osteonectin、BMP2-Wnt/β-catenin的表达以及成骨分化水平与AIS疾病的发展呈负相关。Osteonectin通过激活BMP2-Wnt/β-catenin信号通路,促使β-catenin转录激活成骨分化相关基因,从而促进BMSCs的成骨分化。

芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞氧化应激损伤的保护作用

背景:间充质干细胞移植治疗脊髓损伤有一定效果,但仍存在局部氧化应激环境导致移植细胞存活率低、细胞移植效率不佳等问题。目的:探究芒果苷在氧化应激状态下对骨髓间充质干细胞的保护作用。方法:取第3代大鼠骨髓间充质干细胞,按浓度梯度0,20,40,80,160μmol/L加入芒果苷孵育2 h,然后加入含400μmol/L H_(2)O_(2)的无血清L-DMEM培养基及相应浓度的芒果苷继续培养12 h及24 h,以常规培养的大鼠骨髓间充质干细胞为正常对照组。MTT法检测各组细胞存活情况,按照试剂盒操作方法检测细胞培养液中超氧化物歧化酶、丙二醛及过氧化氢酶水平。结果与结论:与正常对照组相比,H_(2)O_(2)组细胞的存活能力显著降低(P<0.01),超氧化物歧化酶、过氧化氢酶水平显著降低(P<0.01),丙二醛水平显著升高(P<0.01);与H_(2)O_(2)组相比,芒果苷组细胞的存活能力显著升高(P<0.01),超氧化物歧化酶、过氧化氢酶水平显著升高(P<0.01),丙二醛水平显著降低(P<0.01)。芒果苷在20μmol/L浓度以上表现出浓度依赖性的抗氧化应激保护活性,且在160μmol/L以下无细胞毒性。结果表明,抗氧化剂芒果苷可增加骨髓间充质干细胞的抗氧化活性,为骨髓间充质干细胞移植提供一种新的预处理策略。

运动预处理联合骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死

背景:干细胞疗法在改善心肌梗死后心脏重构方面具有广阔前景,但心肌微环境改变影响干细胞疗效。运动预处理类似于缺血预处理,能够对心肌产生保护作用。然而,运动预处理与干细胞移植联合作用的效果与机制鲜有关注。目的:观察运动预处理对心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞移植效果的影响,探讨局部炎症微环境在其中的作用机制。方法:80只雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、移植组和联合组,每组20只。利用结扎冠状动脉左前降支的方法制作心肌梗死大鼠模型,假手术组仅穿线不结扎。移植组和联合组造模后于心肌内注射雄性大鼠来源骨髓间充质干细胞,此外,联合组在造模前还需进行8周跑台运动(即运动预处理)。干细胞移植后4周,采用递增负荷运动力竭实验测定运动能力,超声心动术测定心脏结构与功能,压力容积导管法检测左心室血液动力学,原位染色法进行心肌组织病理学观察并获取心肌胶原容积分数。干细胞移植后1,7 d和4周,采用定量反转录聚合酶链反应检测左心室促炎症因子(白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α)、抗炎症因子(白细胞介素10)、Y染色体性别决定区和胚胎基因(心房钠尿肽、脑钠肽、β-肌球蛋白重链)m RNA表达量。结果与结论:(1)干细胞移植后4周:与假手术组比较,模型组运动能力、左心室射血分数降低(P <0.05);心肌梗死面积、心肌细胞横截面积、胶原容积分数增加(P <0.05);胚胎基因以及促炎因子m RNA表达量上调(P <0.05),白细胞介素10 m RNA表达量下调(P <0.05)。与模型组比较,移植组运动能力、左心室射血分数增加(P <0.05);心肌梗死面积、心肌细胞横截面积、胶原容积分数下降(P <0.05);胚胎基因以及促炎因子m RNA表达量下调(P <0.05),白细胞介素10 m RNA表达量无显著性变化(P> 0.05)。与移植组比较,联合组上述各指标均进一步改善(P<0.05)。(2)干细胞移植后1,7d:与移植组比较,联合组Y染色体性别决定区m RNA表达量升高(P<0.05)。(3)相关分析显示,白细胞介素1β、白细胞介素6(除移植后1 d)、肿瘤坏死因子α与Y染色体性别决定区m RNA表达量呈负相关(P <0.05),白细胞介素10与Y染色体性别决定区m RNA表达量呈正相关(P <0.05)。结果表明:运动预处理能够增强骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死大鼠的效果,表现为心脏重构得到抑制、心功能进一步提升,其机制与心肌炎症微环境改善促进骨髓间充质干细胞滞留和存活有关。

不同静电纺丝膜上骨髓间充质干细胞的黏附、增殖与成血管平滑肌分化

背景:临床上迫切需要小口径人工血管来治疗冠状动脉和外周动脉疾病,目前,血管组织工程已成为制备小口径人工血管的主要方法,选择合适的生物材料和细胞来源是小口径组织工程血管构建成功的关键因素。目的:观察4种静电纺丝膜材料对骨髓间充质干细胞增殖、黏附及分化为血管平滑肌细胞的影响。方法:分离提取SD大鼠骨髓间充质干细胞。将骨髓间充质干细胞分别接种于聚己内酯(PCL)、聚己内酯-透明质酸(PCL-HA)、聚己内酯-丝素蛋白(PCL-SF)、聚己内酯-明胶(PCL-GEL)静电纺丝膜材料上,培养1,3,7 d后,扫描电镜下观察材料上的细胞排布,鬼笔环肽染色观察材料上的细胞增殖与黏附,qRT-PCR检测材料上细胞分泌的CD90、Meflin、转化生长因子βmRNA表达;向血管平滑肌细胞诱导分化7 d后,qRT-PCR检测材料上细胞ɑ-平滑肌肌动蛋白mRNA表达。结果与结论:①扫描电镜下可见骨髓间充质干细胞在4种静电纺丝膜上均沿着静电纺丝膜的纤维走向排列;②鬼笔环肽染色显示,骨髓间充质干细胞在4种静电纺丝膜上分布规律,均沿着纤维走向呈现平行分布,并且PCL-HA、PCL-SF、PCL-GEL静电纺丝膜较PCL静电纺丝膜更有利于骨髓间充质干细胞的增殖、黏附,PCL-SF静电纺丝膜相较于PCL-HA、PCL-GEL静电纺丝膜更有利于骨髓间充质干细胞的增殖、黏附;③qRT-PCR检测显示,4种静电纺丝膜材料均可维持骨髓间充质干细胞CD90和Meflin的mRNA表达,组间比较差异无显著性意义(P>0.05);PCL-HA、PCL-SF、PCL-GEL组培养1,7 d的转化生长因子βmRNA表达高于PCL组(P<0.05),PCL-SF组培养3,7 d的转化生长因子βmRNA表达高于其他3组(P<0.05),PCL-HA组培养7 d的转化生长因子βmRNA表达高于PCL-GEL组(P<0.05);④qRT-PCR检测显示,PCL-SF组ɑ-平滑肌肌动蛋白mRNA表达高于其他3组(P<0.05),PCL-HA组ɑ-平滑肌肌动蛋白mRNA表达高于PCL组(P<0.05);⑤结果表明:相较于PCL、PCL-HA、PCL-GEL静电纺丝膜,PCL-SF静电纺丝膜与骨髓间充质干细胞结合更适合制备小口径组织工程血管。

骨髓间充质干细胞来源的外泌体通过PI3K/AKT信号通路逆转高糖诱导的骨髓间充质干细胞成骨功能障碍

目的:探讨骨髓间充质干细胞来源的外泌体(BMSCs-EXOs)对高糖诱导的骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨功能障碍的作用和机制。方法:利用超速离心法从BMSCs中提取外泌体,并通过透射电子显微镜(TEM)、纳米粒子追踪分析(NTA)、Western blot等方法来评估其特征。用高糖培养基模拟高糖微环境,通过DCFH-DA荧光探针、Western blot、细胞免疫荧光技术(IF)、碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红染色(ARS)等技术来研究BMSCs-EXOs对高糖诱导的BMSCs氧化应激水平、成骨分化和矿化能力的影响。另外,通过PI3K通路阻断剂(LY294002)抑制PI3K磷酸化表达,研究BMSCs-EXOs是否通过激活PI3K/AKT信号通路影响BMSCs的成骨分化和矿化能力。结果:通过TEM、NTA和Western blot可评估从BMSCs中成功提取到的外泌体。与Control组比,HG组氧化应激水平显著升高(P<0.05),HO-1、NQO-1蛋白表达水平显著降低(P<0.05),ALP、ARS活性明显降低(P<0.05),COL1A1、RUNX2、BMP2、p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与HG组比,HG+EXOs组氧化应激水平明显降低(P<0.05),HO-1、NQO-1蛋白表达水平上调(P<0.05),ALP、ARS活性增加(P<0.05),COL1A1、RUNX2、BMP2、p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平上调(P<0.05)。当加入LY294002后,PI3K/AKT信号通路的的磷酸化表达受到了明显的抑制,并且BMSCs-EXOs的促成骨作用也随之受到了明显的减弱(P<0.05)。结论:BMSCs-EXOs通过降低高糖诱导的氧化应激水平,部分恢复了BMSCs的成骨分化和矿化能力,这种促成骨作用可能通过PI3K/AKT信号通路实现的。

高糖环境中程序性细胞死亡受体1抑制大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:程序性细胞死亡受体1(programmed death receptor-1,PD-1)在高糖环境下影响骨髓间充质干细胞成骨分化的作用机制尚不清楚。目的:探讨高糖环境中PD-1对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其调控机制。方法:将大鼠骨髓间充质干细胞随机分为正常糖组(5.6 mmol/L)、高糖组(30 mmol/L)、PD-1过表达组、PD-1过表达空载组、PD-1敲低组、PD-1敲低空载组、PI3K/AKT通路抑制剂组(PD-1敲低+5μmol/L LY294002)。通过在高糖培养基中培养大鼠骨髓间充质干细胞来模拟体外糖尿病环境,采用qRT-PCR检测大鼠骨髓间充质干细胞中PD-1及其配体PD-L1和成骨标志物Runx2、OSX的mRNA表达,采用碱性磷酸酶染色和茜素红S染色观察成骨分化能力,采用CCK-8检测细胞增殖情况,采用Western blot检测PD-1、PD-L1、p-PI3K、p-AKT的蛋白表达。结果与结论:①高糖组PD-1及PD-L1表达显著高于正常糖组,高糖组骨髓间充质干细胞的成骨分化能力较正常糖组显著下降;②敲低PD-1表达可以促进骨髓间充质干细胞的成骨分化、增加细胞增殖活性,同时激活PI3K/AKT通路;③加入PI3K/AKT通路抑制剂LY294002后,骨髓间充质干细胞成骨分化能力显著下降。结果表明:PD-1依赖于PI3K/AKT信号通路抑制高糖环境下大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化。

骨髓间充质干细胞来源外泌体调节大鼠肝细胞凋亡的机制

背景:骨髓间充质干细胞可释放大量外泌体,关于骨髓间充质干细胞来源外泌体对肝细胞凋亡的影响以及具体机制还没有完全阐明。目的:探索骨髓间充质干细胞来源外泌体所携带的miR-21-5p对大鼠肝脏细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞,将miR-21-5p NC或miR-21-5p inhibitor转染到骨髓间充质干细胞中,采用超速离心法提取外泌体,命名为(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos,将外泌体与BRL大鼠肝细胞共培养,观察抑制miR-21-5p表达后对大鼠肝细胞凋亡的影响。通过双荧光素酶报告基因检测验证外泌体中miR-21-5p和PIK3R1之间的靶向关系;TUNEL检测外泌体中miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路对BRL大鼠肝细胞凋亡的影响。结果与结论:①双荧光素酶报告系统证实,PI3KR1野生型载体与miR-21-5p mimics共转染293T细胞时的荧光素酶活性显著低于PI3KR1突变型载体共转染组,表明miR-21-5p可靶向结合PIK3R1;②TUNEL检测结果显示:相比于(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos处理后BRL肝细胞凋亡率显著增加;与(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组相比,加入AKT抑制剂LY294002之后,细胞凋亡率显著增加;③结果提示:外泌体可能通过miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路抑制BRL大鼠肝细胞凋亡。

罗汉果苷V调控高糖状态巨噬细胞M1极化促进骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:糖尿病微环境会造成巨噬细胞过度M1极化,这种高糖炎症状态会抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化,从而影响糖尿病骨缺损的愈合。研究表明罗汉果苷Ⅴ具有抗炎、抗氧化、降血糖的作用,但其能否调节高糖炎症状态下巨噬细胞M1极化及骨髓间充质干细胞的成骨分化尚不清楚。目的:探讨罗汉果苷Ⅴ在高糖炎症状态下调节巨噬细胞M1型极化对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。方法:构建糖尿病C57BL/6小鼠模型,从正常和糖尿病小鼠分离骨髓来源巨噬细胞,分别培养于低糖和高糖培养基。使用脂多糖和干扰素γ作为炎症刺激诱导骨髓来源巨噬细胞的M1型极化,同时以160,320,640μmol/L罗汉果苷Ⅴ干预,用流式细胞术检测F4/80^(+)CD86^(+)细胞比例,qRT-PCR检测诱导型一氧化氮合酶、白细胞介素1β、白细胞介素6的mRNA表达水平,ELISA检测骨髓来源巨噬细胞上清液中肿瘤坏死因子α水平。分离C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,分别使用低糖或高糖成骨诱导液诱导成骨分化,添加M1型巨噬细胞条件培养基作为炎症刺激,以及320μmol/L罗汉果苷Ⅴ干预,成骨诱导14 d后采用qRT-PCR检测碱性磷酸酶、Runt相关因子2、骨钙素、骨桥蛋白的mRNA表达水平,成骨诱导21 d后进行茜素红染色及定量分析。结果与结论:①流式细胞术结果显示320,640μmol/L罗汉果苷Ⅴ组的F4/80^(+)CD86^(+)细胞比例明显低于高糖炎症对照组(P<0.05);②qRT-PCR结果显示160,320,640μmol/L罗汉果苷Ⅴ组的诱导型一氧化氮合酶、白细胞介素6的mRNA相对表达量较高糖炎症对照组显著降低(P<0.05),320,640μmol/L罗汉果苷Ⅴ组白细胞介素1β的mRNA相对表达量较高糖炎症对照组显著降低(P<0.05);③ELISA结果显示160,320,640μmol/L罗汉果苷Ⅴ组的肿瘤坏死因子α分泌水平较高糖炎症对照组显著降低(P<0.05);④320μmol/L罗汉果苷Ⅴ干预后,高糖炎症状态下骨髓间充质干细胞的钙盐沉积增加(P<0.05),且碱性磷酸酶、Runt相关因子2和骨桥蛋白的mRNA相对表达量增加(P<0.05)。结果表明,罗汉果苷Ⅴ可通过抑制高糖炎症状态下骨髓来源巨噬细胞的M1型极化及炎症因子表达,促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。

新橙皮苷治疗骨质疏松症的靶点及对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用

背景:前期研究发现新橙皮苷可以延缓去卵巢小鼠的骨丢失,具有治疗骨质疏松症的潜力,但其具体作用机制仍有待探究。目的:基于生物信息学和体外细胞实验探索新橙皮苷治疗骨质疏松症的关键靶点与可能机制。方法:从GEO数据库获得骨质疏松症相关的基因表达数据集,通过R语言筛选和分析差异表达基因,从GeneCards和DisGeNET数据库筛选骨质疏松症的相关靶点,从ChEMBL和PubChem数据库筛选新橙皮苷的相关靶点,三者取交集获得共同靶点,使用String数据库构建交集基因的PPI网络,筛选关键目标靶点,使用DAVID数据库进行GO、KEGG富集分析,运用AutoDock软件对新橙皮苷与目标靶点蛋白进行分子对接验证。检测新橙皮苷对C57小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响,以完全培养基为空白对照组、成骨诱导液为对照组,含不同浓度(25,50μmol/L)新橙皮苷的成骨诱导液为实验组,在相应时间检测细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶的表达、矿化程度、成骨相关基因及目标靶点基因的表达。结果与结论:(1)筛选出差异表达基因9253个,骨质疏松症相关靶点2161个,新橙皮苷相关靶点326个,三者共同靶点53个,53个基因在骨质疏松症样本中皆上调。PPI网络筛选出具有研究意义的目标靶点基因PRKACA。GO功能与KEGG通路富集分析表明,新橙皮苷通过PRKACA靶点治疗骨质疏松症主要依靠蛋白质磷酸化和蛋白质自身磷酸化等生物过程,作用于内分泌抵抗、癌症中的蛋白聚糖、雌激素信号通路等发挥治疗作用。分子对接结果表明,新橙皮苷与目标靶点PRKACA对应的蛋白有一定的结合能力。(2)碱性磷酸酶染色显示新橙皮苷可以促进间充质干细胞成骨分化早期碱性磷酸酶的表达,茜素红染色显示新橙皮苷可以促进间充质干细胞成骨分化的矿化。RT-qPCR检测结果显示,新橙皮苷可以促进碱性磷酸酶、PRKACA、骨钙素mRNA的表达。(3)结果表明,新橙皮苷可能通过雌激素信号通路上的PRKACA靶点促进成骨分化,从而防治骨质疏松症。

拉伸条件下聚二甲基硅氧烷表面粗糙度对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

背景:研究表明,机械刺激对骨髓间充质干细胞的谱系特异性分化至关重要。然而,机械拉伸条件下不同粗糙度表面的骨髓间充质干细胞成骨分化情况尚不清楚。目的:探讨拉伸条件下聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)表面粗糙度对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及作用机制。方法:通过不同目砂纸(120目、1 000目和10 000目)在PDMS表面构建3种不同粗糙度的形貌(PDMS-120M、PDMS-1000M和PDMS-10000M),与空气接触的PDMS表面作为对照组。采用RT-q PCR检测静态条件下和拉伸条件下(0%,2%,4%,6%拉伸幅度)不同粗糙度PDMS表面的骨髓间充质干细胞中成骨相关基因表达。采用RT-q PCR、Western blot检测2%拉伸条件下不同粗糙度表面骨髓间充质干细胞中SIRT1、成骨相关基因和蛋白表达,采用碱性磷酸酶染色、茜素红染色观察2%拉伸条件下不同粗糙度PDMS表面骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。结果与结论:(1)静态条件下粗糙度为(13.51±2.11)μmPDMS-1000M表面的骨髓间充质干细胞成骨基因表达最高;(2)相对光滑PDMS表面的骨髓间充质干细胞在4%拉伸幅度条件下有更好的成骨分化效果,而PDMS-1000M表面的骨髓间充质干细胞在2%拉伸幅度条件下有更好的成骨分化效果;(3)在2%拉伸幅度条件下,粗糙度为(13.51±2.11)μm PDMS-1000M表面的骨髓间充质干细胞有更好的成骨分化效果,可能与激活SIRT1信号通路有关。

温肾通络止痛方对小鼠H型骨微血管内皮细胞/骨髓间充质干细胞共培养体系的影响

背景:骨骼依赖血管与骨细胞之间的密切连接来维持完整性,骨骼处在生理低氧环境中,因此在低氧环境下研究血管生成与骨生成具有重要意义。目的:探究在低氧环境下温肾通络止痛方对H型骨微血管内皮细胞/骨髓间充质干细胞共培养体系的影响及相关机制。方法:运用酶消化法及流式分选技术,分选小鼠H型血管特异型骨微血管内皮细胞;应用骨髓贴壁法分离获取小鼠骨髓间充质干细胞;采用Transwell小室以及缺氧培养工作站建立两种细胞低氧共培养体系,使用50,100μg/m L质量浓度温肾通络止痛方冻干粉进行干预;通过划痕迁移实验与管形成实验评估共培养体系内H型骨微血管内皮细胞的成血管功能;通过碱性磷酸酶染色与茜素红染色评估共培养体系内骨髓间充质干细胞的成骨分化能力;使用Western Blotting与q-PCR检测共培养体系内H型骨微血管内皮细胞中PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白表达及mRNA表达。结果与结论:(1)与常氧组相比,低氧组H型骨微血管内皮细胞划痕迁移率及新生血管长度均显著升高(P<0.05),骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强(P<0.05);PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白、mRNA表达升高(P<0.05);(2)与低氧组相比,经不同质量浓度温肾通络止痛方干预后H型骨微血管内皮细胞划痕迁移率及新生血管长度进一步提高(P<0.05),骨髓间充质干细胞成骨分化能力更强(P<0.05),PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白、mRNA表达也进一步升高(P<0.05)。结果表明:低氧条件下H型血管生成及骨生成可能与PDGF/PI3K/AKT信号轴有关,而温肾通络止痛方可能通过激活PDGF/PI3K/AKT信号轴促进“H型血管生成-骨生成”作用从而防治骨质疏松症。

血管紧张素Ⅱ对大鼠骨髓间充质干细胞棕色脂肪变的抑制作用

背景:骨髓间充质干细胞是脂肪细胞的来源之一,且表达所有肾素血管紧张素系统成分,但血清血管紧张素Ⅱ对骨髓间充质干细胞向棕色脂肪组织分化的影响尚不清楚。目的:观察血管紧张素Ⅱ对骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞分化的影响,并探究血管紧张素1a型受体敲除对血管紧张素Ⅱ影响骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞分化的作用及可能机制。方法:分离培养野生型SD大鼠及血管紧张素1a型受体敲除SD大鼠的骨髓间充质干细胞,将其培养至第3代,随机分为4组:野生组,基因敲除组,野生+血管紧张素Ⅱ组,基因敲除+血管紧张素Ⅱ组,在棕色脂肪诱导分化培养基中诱导分化14 d,后2组在每次更换分化培养基的同时加入100 nmol/L血管紧张素Ⅱ进行干预。采用Western blot、qRT-PCR、免疫荧光等方法检测棕色脂肪诱导分化、脂肪分解、β氧化和线粒体生物发生等相关标记物的表达。结果与结论:血管紧张素Ⅱ可抑制骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞分化,敲除血管紧张素1a型受体基因能够通过促进脂肪分解、增强脂肪酸β氧化、促进线粒体生物发生、增强线粒体功能来改善血管紧张素Ⅱ对骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞分化的抑制作用。这些发现为肥胖治疗提供了新的研究方向和潜在治疗靶点,揭示了肾素血管紧张素系统在脂肪代谢中的重要作用及其作为治疗目标的潜力。

颌骨来源骨髓间充质干细胞成骨分化的特点、优势与应用

背景:颌面部骨组织缺损修复是目前研究的热点与难点,而种子细胞的选择是关键。颌骨来源骨髓间充质干细胞是存在于颌骨内的成体间充质干细胞,在颌面部组织再生方面的应用更具优势。目的:综述颌骨来源骨髓间充质干细胞的生物学特性和成骨分化优势以及药物、体内环境、微小RNA对其成骨分化影响的相关研究进展。方法:利用计算机在PubMed和中国知网进行文献检索。中文检索词为“口腔,骨组织工程,干细胞”,英文检索词为“oral,bone tissue engineering,stem cells”。共检索下载文章405篇,根据纳入与排除标准对文章进行筛选,最终纳入70篇文献进行综述。结果与结论:颌骨来源骨髓间充质干细胞是口腔骨组织工程的优良种子细胞,与长骨骨髓间充质干细胞相比,颌骨来源骨髓间充质干细胞具有更强的增殖能力和成骨分化能力。药物、体内环境、微小RNA均可以调控颌骨来源骨髓间充质干细胞的成骨分化,但目前对颌骨来源骨髓间充质干细胞的研究尚处于初始阶段,因此需要更多论证力较强的研究来证实其在颌面部骨组织再生领域的应用更具优势。

骨髓间充质干细胞来源的miR-199a-5p通过抑制ZIK1/MAP3K11调节肾细胞癌细胞的增殖和侵袭

目的:研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)来源的外泌体(exsome)中miR-199a-5p对肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)细胞增殖和侵袭的影响。方法:分离骨髓间充质干细胞来源的外泌体(BM-MSCs-Exo),电子显微镜观察外泌体形态,Western blot方法检测外泌体标志蛋白CD9和CD63。CCK-8法检测RCC细胞在不同条件下的增殖速度,Transwell法检测RCC细胞的侵袭能力,q-PCR法检测miR-199a-5p以及ZIK1和MAP3K11的mRNA表达,双荧光素酶实验验证miR-199a-5p以及ZIK1和MAP3K11基因的3’UTR区域靶向结合。结果:BM-MSCs-Exo电镜下呈圆形囊泡状,直径约100 nm,且高表达CD9和CD63,RCC细胞摄取BM-MSCs-Exo后增殖和侵袭能力均被抑制,过表达miR-199a-5p的BM-MSCs-Exo能显著抑制RCC细胞的增殖和侵袭能力,抑制BM-MSCs-Exo中的miR-199a-5p后能缓解BM-MSCs-Exo对RCC的抑制作用,且发现过表达miR-199a-5p的BM-MSCs-Exo能显著降低ZIK1和MAP3K11的mRNA表达,而在BM-MSCs-Exo中抑制miR-199a-5p有相反作用。结论:BM-MSCs-Exo通过向RCC细胞转运miR-199a-5p抑制ZIK1和MAP3K11的表达,进而抑制RCC细胞的增殖和侵袭。

miR-192-5p靶向CKIP-1促进骨质疏松患者骨髓间充质干细胞成骨分化

背景:酪蛋白激酶2结合蛋白1(casein kinase 2-interaction protein-1,CKIP-1)是一种重要的骨形成负调控基因,其敲除鼠骨质显著增强、骨形成和骨密度也显著提高。而miRNA作为较早发现的小分子调控物,对大多数编码基因具有调控作用,在成骨分化中发挥重要作用。目的:探讨miRNA/CKIP-1对骨质疏松患者骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其分子机制。方法:采用miRNA-Seq技术检测2022年3-6月在开封市中心医院骨外科就诊32例骨质疏松患者及同期体检中心健康人群骨髓间充质干细胞中miRNA的变化情况;利用Targetscan网站预测靶向调控CKIP-1的miRNA,利用荧光素酶报告基因实验检测miRNA与CKIP-1启动子区DNA的结合;在骨髓间充质干细胞中转染miR-192-5p类似物(miR-192-5p mimics)/阴性对照(NC mimics)或miR-192-5p抑制剂(miR-192-5p inhibitor)/阴性对照(NC inhibitor),成骨诱导后第7,14天,通过实时荧光定量PCR技术及茜素红染色检测成骨标志基因Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素、抗骨桥蛋白、骨唾液蛋白及CKIP-1的表达水平和骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的情况;采用蛋白质免疫印迹实验及茜素红染色检测miR-192-5p/CKIP-1/轴对细胞成骨分化的的调控作用。结果与结论:与健康组相比,骨质疏松组有16个miRNA表达明显升高,53个miRNA表达明显降低(P<0.05);利用Targetscan网站预测,并通过荧光素酶报告基因实验验证,发现miR-192-5p与CKIP-1有互补的核苷酸序列(P<0.05);过表达miR-192-5p,Runx2、骨钙素、骨桥素和骨唾液蛋白的表达水平显著升高(P<0.05),抑制miR-192-5p,Runx2、骨钙素、骨桥素和骨唾液蛋白的表达水平显著降低(P<0.05),而沉默CKIP-1的表达后,Runx2、骨钙素及骨桥素的蛋白水平增加(P<0.05),逆转了敲低miR-192-5p对细胞成骨分化的抑制作用。上述结果证实,miR-192-5p在骨质疏松症中表达降低;miR-192-5p通过靶向抑制CKIP-1的表达,促进骨髓间充质干细胞成骨分化。

“脾肾相赞”理论探讨不同治法对大鼠骨髓间充质干细胞成肌分化中TNF-α、JNK含量影响

目的在“脾肾相赞”理论指导下,比较不同中医治法对大鼠BMSCs成肌分化及过程中TNF-α、JNK蛋白表达的影响,分析中医治疗骨质疏松症的机制。方法将大鼠分为正常组、诱导组、补肾组、健脾组、补肾健脾组(随机数字表法),制备含药血清,选取第4代BMSCs进行实验,运用免疫荧光法分析各组成肌分化情况,酶联免疫吸附法检测TNF-α、JNK蛋白表达量。结果①BMSCs经诱导15d后,通过免疫荧光化学染色法检测MyoG荧光平均强度,结果显示:各组均显著高于正常组(P<0.01),补肾健脾组最高。②TNF-α蛋白检测:补肾组、补肾健脾组显著低于正常组(P<0.01)。③JNK蛋白检测:各组显著低于正常组(P<0.01)。结论①各治法中,补肾健脾法对大鼠BMSCs成肌分化的促进效果最佳,为通过脾肾、肌骨双方向治疗OP提供可能。②各中医治法均对大鼠BMSCs的成肌分化存在促进作用,这可能与降低TNF-α、JNK水平有关。

人甲床来源的脱细胞支架搭载骨髓间充质干细胞向指甲干细胞分化的研究

目的探究人甲床来源的脱细胞支架搭载骨髓间充质干细胞向指甲干细胞分化的作用。方法收集2022年至2023年在承德医学院附属医院手足外科进行截指术的15例患者的临床废弃甲床组织,制备成脱细胞甲床支架,使用试剂盒检测参照组(未脱细胞组)与脱细胞组(脱细胞甲床支架组)中总胶原蛋白含量、残留DNA含量;将脱细胞甲床支架与人骨髓间充质干细胞(hMSCs)进行共培养14 d。比较对照组(hMSCs组)与共培养组(脱细胞甲床支架+hMSCs组)体外细胞分化能力及指甲干细胞标志物[角蛋白15,角蛋白17,G蛋白偶联受体6(Lgr6)以及β-联蛋白(β-catenin)蛋白]含量。结果脱细胞组总胶原蛋白含量为(189.62±45.45)μg/mg,低于参照组[(196.02±41.93)μg/mg],但两组相比差异无统计学意义(P>0.05);脱细胞组中DNA含量为(0.41±0.15)μg/mg,明显低于参照组[(0.87±0.13)μg/mg],差异有统计学意义(P<0.05)。培养14 d后,共培养组吸光度值为1.09±0.07,对照组吸光度值为1.10±0.5,两组相比差异无统计学意义(P>0.05)。培养14 d后,共培养组角蛋白15、角蛋白17、Lgr6、β-catenin含量分别为(39.56±5.09)、(45.83±4.01)、(5.74±0.99)、(146.79±5.34)pg/mL,均明显高于对照组[(12.10±4.28)、(10.47±3.19)、(0.93±0.67)、(67.28±7.41)pg/mL],差异均有统计学意义(P<0.05)。结论脱细胞甲床支架中的DNA有被清除、保留胶原蛋白,与hMSCs共培养后细胞增殖能力正常,且可诱导hMSCs向指甲干细胞分化,为临床上治疗甲床缺损提供新思路。

附子理中汤联合骨髓间充质干细胞调控变应性鼻炎大鼠鼻黏膜T-bet和GATA3 mRNA表达的研究

目的研究附子理中汤联合骨髓间充质干细胞(MSCs)对变应性鼻炎大鼠鼻黏膜T盒转录因子(T-bet)、锌指蛋白3(GATA3)mRNA表达的影响。方法将40只雄性SD大鼠随机分为5组,每组8只。对照组大鼠不造模、不干预;模型组、MSCs组、附子理中汤组、附子理中汤+MSCs组大鼠均进行变应性鼻炎造模,其中模型组造模后不治疗,MSCs组造模后给予骨髓MSCs尾静脉注射1次,附子理中汤组造模后给予附子理中汤连续灌胃14 d,附子理中汤+MSCs组造模后给予骨髓MSCs尾静脉注射1次和附子理中汤连续灌胃14 d。比较各组大鼠干预前后的行为学积分;干预结束后ELISA法检测鼻腔灌洗液中白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-13(IL-13)、干扰素-γ(IFN-γ)水平,qRT-PCR法检测鼻黏膜组织中T-bet和GATA3 mRNA表达情况。结果MSCs组、附子理中汤组和附子理中汤+MSCs组大鼠干预后行为学积分均明显低于干预前及模型组(P均<0.05),且附子理中汤+MSCs组大鼠干预后行为学积分均明显低于MSCs组和附子理中汤组(P均<0.05)。与对照组比较,模型组大鼠鼻腔灌洗液中IL-4、IL-13水平和鼻黏膜组织中GATA3 mRNA相对表达量均明显升高(P均<0.05),鼻腔灌洗液中IFN-γ水平和鼻黏膜组织中T-bet mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05)。与模型组比较,MSCs组、附子理中汤组和附子理中汤+MSCs组大鼠鼻腔灌洗液中IL-4、IL-13水平和鼻黏膜组织中GATA3 mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05),附子理中汤组和附子理中汤+MSCs组大鼠鼻腔灌洗液中IFN-γ水平和鼻黏膜组织中T-bet mRNA相对表达量均明显升高(P均<0.05),MSCs组大鼠鼻腔灌洗液中IFN-γ水平和鼻黏膜组织中T-bet mRNA相对表达量均无明显变化(P均>0.05);且附子理中汤+MSCs组大鼠鼻腔灌洗液中IL-4、IL-13水平和鼻黏膜组织中GATA3 mRNA相对表达量均明显低于MSCs组(P均<0.05),鼻腔灌洗液中IFN-γ水平和鼻黏膜组织中T-bet mRNA相对表达量均明显高于MSCs组(P均<0.05)。结论附子理中汤联合骨髓MSCs能上调T-bet mRNA和下调GATA3 mRNA表达,进而调节Th1/Th2细胞的平衡,抑制炎症反应,改善变应性鼻炎症状。