5-氮杂胞苷诱导骨髓源性心肌干细胞向心肌分化过程中心肌肌钙蛋白T的表达变化

目的研究5_氮杂胞苷诱导骨髓源性心肌干细胞(MCSC)向心肌分化过程中,心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达变化和超微结构。方法从SD大鼠骨髓间充质干细胞(MMSC)中筛选MCSC,用5_氮杂胞苷诱导向心肌定向分化。取分化后不同时间的细胞作cTnT免疫细胞化学染色,并对结果进行图像分析。透射电镜下观察分化细胞的超微结构。取不同发育期和成熟期的SD大鼠心肌作对比研究。结果用5_氮杂胞苷诱导后2周,细胞内开始表达cTnT;诱导后3周,cTnT表达增强,可见横纹样结构;诱导后4周,cTnT表达明显增强,横纹增多,但排列不规则。诱导后4周的细胞内出现心房粒,可见丰富的粗面内质网和糖原。胚胎11d大鼠的心肌内,横纹样结构较少且排列不规则。新生大鼠心肌内横纹增多,排列较规则。1月龄和3月龄心肌的横纹样结构发达,排列规则。诱导分化后4周的细胞cTnT表达特征与胚胎11d的心肌相似。结论MCSC经5_氮杂胞苷诱导后可分化为心肌细胞,表现为未成熟心肌的结构和功能特征。

骨形态发生蛋白-2在骨髓源性心肌干细胞向心肌分化中的作用

目的研究骨形态发生蛋白-2(BMP-2)对骨髓源性心肌干细胞(MCSC)向心肌分化的作用,探讨MCSC向心肌分化中的BMP-2信号转导机制.方法从SD大鼠骨髓中筛选MCSC,用BMP-2诱导向心肌定向分化.RT-PCR检测诱导前后BMP-2受体BMPRIA和BMPRII、心肌早期转录因子Nkx2.5和GATA-4以及cTnT mRNA的表达.免疫细胞化学标记诱导后细胞cTnT和Cx-43的表达.结果用BMP-2诱导后,MCSC的形态和排列发生变化.RT-PCR检测结果显示,诱导前BMPRIA和BMPRII以及Nkx2.5和GATA-4呈低表达,诱导后1周表达增加,3～4周表达明显.cTnT mRNA在诱导前不表达,诱导后1周开始表达,3～4周表达明显.免疫细胞化学染色显示,cTnT和Cx-43从诱导后2周开始表达.3～4周cTnT表达增强,呈现密集的横纹样结构.Cx-43在2周位于细胞膜下,3周分布于相邻细胞连接处,4周呈颗粒状密集分布于肌管的相邻细胞连接处. 结论BMP-2通过BMPRIA和BMPRII的介导作用诱导MCSC分化为心肌细胞.

Smad信号通路在骨髓源性心肌干细胞向心肌分化中的作用

目的研究Smad信号通路在BMP_2诱导的骨髓源性心肌干细胞(MCSCs)向心肌分化中的作用,探讨MCSCs向心肌分化的信号转导机制。方法从SD大鼠骨髓中筛选MCSCs,用骨形态发生蛋白-2(BMP_2)诱导向心肌定向分化。Westernblotting和免疫细胞化学法检测诱导后细胞内磷酸化的Smadl/5/8的表达及其随诱导时间在细胞内分布的变化。RT_PCR检测诱导前后细胞内GATA_4和心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)mRNA的表达。结果BMP_2诱导后15min,细胞内可检测到磷酸化的Smadl/5/8的表达,30min^1h表达明显增加,1h后开始降低,4h呈低表达。BMP_2诱导后15min,磷酸化的Smadl/5/8仅见于胞质中,30min胞质和胞核均见表达,1h主要在胞核内表达。BMP_2诱导后2周,细胞明显表达GATA_4和cTnTmRNA。诱导后4周细胞呈现成熟心肌细胞样形态。用SB203580抑制Smad信号后,GATA_4和cTnTmRNA的表达显著降低,细胞形态变化不明显。结论Smad信号通路在BMP_2诱导MCSCs向心肌分化中发挥重要的介导作用。

PI3-K/Akt信号通路对骨髓源性心肌干细胞分化的调控作用

目的研究磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（PI3-K/Akt）信号通路在骨形态发生蛋白-2（BMP-2）诱导骨髓源性心肌干细胞（MCSCs）向心肌细胞分化中的调控作用,探讨MCSCs向心肌细胞分化的信号转导机制。方法利用单克隆培养技术从SD大鼠骨髓中筛选MCSCs,用BMP-2诱导其向心肌细胞定向分化,通过免疫细胞化学标记和Western blotting检测BMP-2诱导后细胞内p-Akt水平的变化,并通过RT-PCR检测心肌早期转录因子和心肌特异基因的表达。结果BMP-2诱导前MCSCs内p-Akt水平较低,诱导后渐增强,20~30min达高峰,1h后逐渐降低。用PI3-K抑制剂Ly294002预处理细胞后,p-Akt水平明显降低。RT-PCR检测显示,诱导前MCSCs的Nkx2.5和GATA-4呈低表达,诱导后2周表达增强,4周表达更加明显。cTnT和Cx-43 mRNA在诱导前未见表达,诱导后2周表达明显,4周表达增强。用Ly294002处理后,细胞的Nkx2.5、GATA-4和cTnT、Cx-43 mRNA的表达显著降低,细胞形态变化不明显。结论BMP-2能诱导MCSCs向心肌细胞分化,PI3-K/Akt信号通路在BMP-2诱导MCSCs向心肌细胞分化中发挥重要的调控作用。

纤维蛋白胶对骨髓源性心肌干细胞增殖、迁移和缺血缺氧后的保护作用

目的探讨纤维蛋白胶(FG)对骨髓源性心肌干细胞(MCSC)增殖、迁移和存活的作用,为临床应用干细胞移植治疗心肌梗死等缺血性疾病提供实验手段和理论依据。方法将MCSC接种于FG中制备FG-MCSC,经AO/EB染色选择合适浓度的FG,用细胞计数法检测MCSC在FG中的增殖,通过损伤和自然迁移实验评价MCSC从FG中的迁出。建立细胞缺血缺氧模型(OGD),用AO/EB染色和乳酸脱氢酶(LDH)泄漏法检测FG对MCSC的保护作用。结果 MCSC在低浓度FG中保持较高的活力和增殖能力。接种后1d和2d,仅有少量细胞从FG的刮除线边缘迁出。在接种后3d,有大量细胞从FG中迁出。经缺血缺氧处理后,MCSCOGD组中存活、凋亡和坏死细胞数目分别为14.09±2.05、61.11±5.20和24.80±4.99。与MCSC OGD组相比,FG-MCSC OGD组MCSC的存活数目(61.01±8.86)较高,凋亡(31.67±8.27)和坏死(7.33±2.70)细胞数目较低。MCSC经缺血缺氧处理后,FG-MCSC OGD组LDH的水平明显低于MCSC OGD组。结论低浓度FG作为一种天然生物材料可以为MC-SC的生长提供良好的微环境。在缺血缺氧条件下,低浓度FG能够保护MCSC免受缺血缺氧损伤,促进细胞存活。

自聚肽纳米纤维支架承载骨髓源性心肌干细胞移植治疗心肌梗死的实验研究

目的探讨自聚肽纳米纤维支架承载骨髓源性心肌干细胞(MCSC)移植对大鼠心肌梗死后心功能恢复的影响,寻找一种更适合承载心肌干细胞治疗心肌梗死的可注射性生物材料。方法通过单细胞克隆培养技术,从骨髓间充质干细胞中筛选具有心肌特异分化潜能的MCSC,固相合成自聚多肽。将雌性大鼠心肌梗死模型随机分为3组:对照组、MCSC移植组、支架承载MCSC移植组。细胞移植后4周,用M型超声心动图检测心功能恢复情况;对心脏组织切片进行Masson染色,利用图像分析检测胶原纤维比率;用原位荧光杂交法标记心肌组织中Y染色体细胞,并检测其心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达。结果支架承载MCSC移植组与MCSC移植组相比,大鼠的心功能指数明显提高,胶原纤维比率明显减小,Y染色体阳性细胞数明显增多,差异均具有统计学意义。结论支架承载MCSC移植治疗心肌梗死,有利于移植细胞在受损心肌内的存活和向功能性心肌分化,并促进心功能恢复,其疗效优于单纯干细胞移植。

自聚肽纳米纤维支架对骨髓源性心肌干细胞的作用研究

目的研究白聚肽纳米纤维支架对骨髓源性心肌干细胞（MCSCs）生长和存活的作用。方法设计和同相合成自聚肽，扫描电镜和原子力显微镜下观察其白组装后的形态结构和与MCSCs的相互关系；通过CCK-8法和免疫荧光染色检测纳米纤维支架对MCSCs增殖和分化情况。结果1％多肽溶液自组装成直径约10nm，长度为100～300nm纳米纤维，并相互交织成孔径为50～200nm的网状结构；MCSCs在纤维支架中培养1d后，可见细胞呈长梭形，位于三维纳米纤维支架的网孔中，生长状态良好；生长曲线显示细胞在纤维支架中的增殖能力明显高于对照组；MCSCs在纤维支架中诱导培养4周时，形态和排列方式均发生明显改变。结论纤维支架与MCSCs有良好生物相容性，纤维支架有利于MCSCs的生长和定向分化。

骨形态发生蛋白-2诱导骨髓源性心肌干细胞向心肌细胞分化过程中形态和电生理特性的变化

目的研究骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导骨髓源性心肌干细胞(MCSCs)向心肌分化中细胞形态变化、特异性蛋白的表达以及电生理学特征变化。方法从SD大鼠骨髓中筛选MCSCs,用10 ng/mL BMP-2诱导培养24 h后,换成含10%胎牛血清的DMEM继续培养。相差显微镜下观察细胞的形态变化,免疫细胞化学染色观察诱导后细胞心肌特异性蛋白cTnT的表达。以正常大鼠心室肌细胞为对照,用全细胞膜片钳技术记录诱导后细胞的动作电位(AP)和L型钙电流(ICa-L)。结果 BMP-2诱导后MCSCs的形态和排列方式发生变化。诱导后4周,可见多个细胞相互连接形成肌管样结构,cTnT表达呈现密集的横纹样。诱导后3周,可记录到具有心室肌细胞特点的AP,但平台期不明显;4周细胞的AP出现明显的平台期,类似于成年大鼠心室肌细胞的AP。诱导后3周可记录到ICa-L,但电流值较小;4周细胞ICa-L的电流值增大,激活电位为-40 mV,最大激活电位为0 mV,反转电位为+60 mV,与成年大鼠心室肌细胞的ICa-L相似。结论 BMP-2能够诱导MCSCs向心肌分化,分化后的细胞在形态和电生理学方面具有功能性心肌细胞的特征。

二氮嗪预处理骨髓源性心肌干细胞移植治疗心肌梗死的实验研究

目的探讨二氮嗪预处理骨髓源性心肌干细胞(MCSCs)移植治疗心肌梗死的机制及效果。方法通过单细胞克隆培养技术,从雄性幼鼠骨髓间充质干细胞中筛选具有心肌特异分化潜能的MCSCs;将雌性大鼠心肌梗死模型随机分为对照组、MCSCs移植组、二氮嗪预处理MCSCs移植组;细胞移植后4周,用M型超声心动图检测心功能恢复情况,心脏组织切片进行Masson染色,利用图像分析检测胶原纤维比率,用原位荧光杂交法标记心肌组织中Y染色体细胞,并检测其cTnT的表达。结果二氮嗪预处理细胞移植组与MCSCs移植组相比,大鼠的心功能指数明显提高,胶原纤维比率明显减小,Y染色体阳性细胞数明显增多,差异均有统计学意义。结论二氮嗪预处理MCSCs移植治疗心肌梗死,有利于移植细胞在受损心肌内的存活,并促进心功能恢复,其疗效优于单纯干细胞移植。

二氮嗪预处理对大鼠骨髓源性心肌干细胞抗氧化应激的作用

目的探讨二氮嗪预处理对大鼠骨髓源性心肌干细胞(MCSCs)在氧化应激条件下的作用。方法利用过氧化氢溶液(H2O2)处理MCSCs造成氧化应激损伤,Annexin V/PI双标记法检测细胞凋亡的情况,采用RT-PCR和免疫印迹检测二氮嗪预处理对细胞的基因表达和Akt磷酸化水平的影响。结果经二氮嗪预处理后,在氧化应激条件下MCSCs凋亡率下降,细胞的肝细胞生长因子和碱性成纤维生长因子mRNA表达显著增加,磷酸化Akt水平明显上调。结论二氮嗪预处理可以提高大鼠MCSCs的抗氧化应激能力,其机制与提高细胞的HGF和bFGF基因表达和Akt磷酸化水平有关。

不同年龄大鼠骨髓源性心肌干细胞生物学特性的比较

目的研究不同年龄大鼠骨髓源性心肌干细胞（MCSCs）形态和衰老相关指标的差异,探讨年龄因素对MCSCs增殖、存活和向心肌细胞分化的影响。方法利用单细胞克隆培养技术从幼年、成年和老年雄性SD大鼠骨髓中筛选MCSCs,透射电镜下观察细胞超微结构改变。SA-β-半乳糖苷酶染色和活性氧（ROS）染色检测细胞衰老变化,流式细胞术分析细胞周期分布。Annexin V/PI双标流式细胞术和Hochest33342染色检测细胞存活和凋亡。用骨形态发生蛋白-2（BMP-2）诱导不同年龄组MCSCs向心肌细胞分化,通过RT-PCR检测诱导后心肌早期转录因子和心肌特异基因的表达,并通过免疫细胞化学染色检测各年龄组细胞经（BMP-2）诱导后细胞内心肌特异性肌钙蛋T（cTnT）表达的变化。结果老年组MCSCs核质比减小,胞质内可见髓样小体。随着年龄增长,处于增殖期的MCSCs比例下降,β-半乳糖苷酶和ROS阳性细胞数目增多。老年组存活细胞比例较幼年组降低。用BMP-2诱导后4周,幼年组细胞的Nkx2.5、GATA-4和cTnT、Cx-43 mRNA表达明显,成年组和老年组细胞表达低于幼年组,差异有显著性意义。免疫细胞化学染色显示,BM...

干细胞外切体对大鼠心肌缺血再灌注损伤及Akt/GSK-3β通路的影响

目的探讨骨髓源性心肌干细胞来源的外切体对大鼠心肌缺血再灌注损伤及Akt/GSK-3β通路的影响。方法64只SD大鼠随机分为假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)、外切体干预组(Ex组)、外切体干预联合PI3K抑制剂组(Ex+L组)。再灌注后2 h各组取8只大鼠,ELISA法测定血清乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平,Western blot测定检测心肌组织Akt和P-GSK-3β水平;其余8只大鼠存活4周后用Masson染色检测心肌组织中胶原纤维。结果与I/R组相比,Ex组血清CK-MB、LDH水平降低,心肌胶原纤维减少,心肌Akt和P-GSK-3β水平增加(均P<0.01)。结论骨髓源性心肌干细胞来源的外切体可减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤,这种保护作用可能与Akt/GSK-3β信号通路激活有关。

功能化纳米支架承载干细胞移植治疗大鼠心肌梗死的研究

目的:探讨功能化纳米纤维支架(NFS)承载骨髓源性心肌干细胞(MCSCs)移植对大鼠心肌梗死(MI)后心功能恢复的影响,寻找一种更适合承载MCSCs治疗MI的可注射性生物材料。方法:通过单细胞克隆培养技术,从骨髓间充质干细胞中筛选具有心肌特异分化潜能的MCSCs,并固相合成自聚多肽。将24只雌性大鼠MI模型随机分为3组,即对照组、MCSCs移植组和支架承载MCSCs移植组,每组8只。细胞移植后4周,用M型超声心动图检测心功能恢复的情况。将心脏组织切片并进行Masson染色,利用图像分析检测胶原纤维的比率。采用原位荧光杂交法标记心肌组织中的Y染色体细胞,并检测心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达。结果:与MCSCs移植组相比,支架承载细胞移植组大鼠的心功能指数明显提高,胶原纤维比率明显减小,Y染色体阳性细胞数明显增多(P<0.05)。结论:支架承载MCSCs移植治疗MI,有利于移植细胞在受损心肌内的存活和向功能性心肌细胞分化,并可促进心功能恢复,其疗效优于单纯干细胞移植。

MCSCs-exosomes对成年大鼠心肌细胞缺氧损伤的干预作用

目的探讨来源于骨髓源性心肌干细胞的外切体(MCSCs-exosomes)对成年大鼠心肌细胞体外缺氧损伤诱导凋亡的干预作用。方法将体外培养的成年大鼠心肌细胞随机分为对照组、缺氧组和MCSCs-exosomes预处理组。随后进行形态学观察、细胞计数,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白(Bcl-2,bax)的表达变化,流式细胞仪检测凋亡率的变化。结果与对照组相比,缺氧组细胞凋亡相关指标均明显升高,细胞计数下降(P<0.01),Bcl-2/bax表达下调(P<0.01),凋亡细胞比例明显增多。而MCSCsexosomes预处理组可明显改善缺血缺氧损伤时的细胞活力,上调Bcl-2/bax的表达,降低凋亡细胞的比例(P均<0.05)。结论 MCSCs-exosomes预处理可以明显改善体外培养缺氧损伤诱导的成年大鼠心肌细胞的凋亡情况,其机制可能是通过抗凋亡途径减轻缺氧时细胞的损伤。

发育心肌和心肌干细胞分化后心肌特异蛋白表达的比较研究

为探讨MCSC移植修复缺血性心肌的可能性,观察了大鼠发育心肌和MCSC分化为心肌细胞的cTnT和Cx-43表达特点。结果表明从胚胎发育至成年,心肌cTnT mRNA表达逐渐上调;用BMP-2诱导1周的MCSC可检测到cTnT mRNA表达,3～4周表达显著升高,诱导2周能观察到cTnT蛋白,3～4周可见cTnT呈现横纹样结构。胚胎第11 d心肌可检测到Cx-43 mRNA表达,生后7 d达高峰,以后逐渐降低,17 d趋于稳定。胚胎期Cx-43蛋白多分布于肌膜下,生后10 d位于细胞连接处。诱导的MCSC中Cx-43 mRNA表达特征与cTnT mRNA相似,2周可观察到Cx-43蛋白,3～4周可见Cx-43位于相邻细胞连接处。本研究结果提示,在BMP-2诱导下MCSC可分化为心肌细胞,表现为成熟心肌细胞的结构特征。MCSC有望成为治疗缺血性心脏病的理想种子细胞。