成人骨髓源性神经干细胞诱导分化实验研究

为探讨成人骨髓分离培养神经干细胞的可行性和有效性 ,无菌条件下行骨穿 ,梯度密度离心分离获取成人骨髓源细胞 ,以“CYTOKINE·神经干细胞培养液”培养 ,确定神经干细胞的最佳体外生存环境。以细胞克隆方法判断神经干细胞增殖情况 ;以NESTIN、NSE及GFAP免疫细胞化学方法分别鉴定神经干细胞、神经元和神经胶质细胞。细胞培养所涉及的细胞因子主要有GDNF(2 0ng/ml)、LIF(10ng/ml)和RA(0 5 μg/ml)等。结果发现 ,成人骨髓源细胞在相应培养条件下快速分裂增殖为大而圆并含粗大胞质颗粒的神经干细胞 ,后者形成细胞球 (或称“神经球”) ,该细胞球表达特殊的神经干细胞NESTIN抗原 ;若进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度培养 ,单个的细胞又很快形成新的神经球。神经干细胞球进一步分化 ,可见到有的细胞胞体增大并出芽 ,逐渐发育成为较成熟的长突起细胞 ,长突起相互连接、交织成网并建立有神经纤维样联系 ,表达NSE或GFAP抗原。说明成年人骨髓在一定条件诱导下可以生成神经干细胞 ;

绿荧光蛋白标记人骨髓源性神经干细胞的体外实验研究

目的:探讨重组腺相关病毒包装绿荧光蛋白(rAAV-GFP)标记人骨髓源性神经干细胞(BM.NSCs)的可行性,为进一步行标记细胞移植实验研究奠定基础。方法:以成人自愿者的骨髓为研究对象,梯度密度离心法分离获取骨髓基质细胞并用“Cytokine·神经干细胞培养基”诱导分化为神经干细胞,分化的细胞以免疫细胞化学鉴定。对接种生长的BM.NSCs(1×105～6/mL)以无血清培养基冲洗并重悬细胞,依最佳病毒感染指数(MOI)为105的标准计算、加入包装了GFP的rAAV病毒颗粒,连续培养12h(37℃,50mL/LCO2)以感染细胞;补加100g/L胎牛血清后,于神经干细胞培养基中继续细胞培养24h(37℃,50mL/LCO2)以上,荧光显微镜(OlympusIX70,Japan)追踪观察rAAV-GFP标记的BM.NSCs。结果:BM.NSCs于标记后1周内见不到GFP阳性表达;在标记10d后才出现有GFP阳性表达情况(平均每个200倍镜下视野可见到5～10个GFP阳性细胞),所标记的细胞在荧光显微镜下呈亮绿色;随着培养时间延长,BM.NSCs表达GFP也逐渐增强、阳性细胞数量逐渐增多,并可于1个月时最明显(标有GFP阳性的细胞可达BM.NSCs总数的60%),追踪观察到到2.5个月时亦未见衰减。结论:rAAV-GFP在人骨髓源性神经干细胞中的表达较迟,但呈渐强趋势;rAAV-GFP标记人骨髓源性神经干细胞具有可行性。

兔骨髓源性神经干细胞体外分化为神经元样细胞的功能特性研究

目的:检测由骨髓源性神经干细胞诱导分化而成的神经元样细胞,能否分泌γ-氨基酸(γ-aminobutyricacid,GABA)神经生物活性物质成分,从而初步推断是否具有神经元的生化特征。方法:无菌条件下抽取新西兰大白兔骨髓,梯度密度离心分离获取骨髓基质细胞(bonemarrowstromacells,BMSCs),在神经干细胞培养基及脑源性神经营养因子(BDNF)等条件下,于体外诱导分化为神经干细胞及神经元样细胞,采用免疫细胞化学方法进行鉴定,并应用高效液相色谱法(HPLC)检测GABA生物活性物质的含量。结果:BMSCs培养12d可见细胞大而圆,免疫细胞化学检测巢蛋白抗原阳性;培养20d可见具有长突起的神经元样细胞形成,神经元核蛋白免疫细胞化学检查阳性,HPLC检测骨髓源性神经元样细胞含有高浓度GABA神经递质成分。方差分析显示:随着BMSCs培养天数的增加,其所含的GABA浓度也渐增加,由每1×107细胞中(3.43±0.25)μmol/L增至(14.69±3.51)μmol/L(F=23.69,P=0.0014)。结论:兔BMSCs在体外条件下可以增殖分化,前期表达Nestin,分化的细胞则可表达NeuN特异性抗体,并含有高浓度的类GABA神经递质成分。

康复训练对脊髓损伤大鼠外源性移植的骨髓源性神经干细胞的影响

目的:研究康复训练对移植到脊髓损伤大鼠体内的骨髓源性神经干细胞的存活、迁移、分化以及大鼠功能恢复的影响。方法:制作40只T10脊髓损伤动物模型,随机分成4组,分别为移植组(Y组)、康复训练组(K组)和康复训练联合细胞移植组(L组)、对照组(C组),在脊髓损伤后第7天将培养并标记好的骨髓源性神经干细胞移植到Y、L组中。分别在脊髓损伤后1、3、7d及2、3、4、5、6周对所有动物进行BBB评分。免疫荧光染色观察移植的细胞在脊髓内的迁移、分化的情况。结果:BBB评分显示,细胞移植2周后,L组评分明显高于其他各组(P<0.01)。免疫荧光染色显示,L组动物的神经干细胞存活率较Y组好,分化为神经元的比例更高。结论:康复训练能够促进移植的神经干细胞在脊髓中的存活并能促进其分化,有益于脊髓损伤大鼠后肢功能的恢复。

dsRNA阻断大鼠骨髓源性神经干细胞Hes5表达的实验研究

目的 观察外源性短双链RNA(dsRNA)在转录后水平即mRNA水平降低基因表达的效率，并对其影响因素进行初步探讨。方法 将体外分离培养的大鼠骨髓基质细胞，通过由本实验室配制的特殊培养基诱导成神经干细胞，应用人工合成的dsRNA于不同浓度转染神经干细胞，Western bloting检测dsRNA是否能阻断转录因子Hes5的表达，0．5％锥虫蓝法测定各浓度组中培养细胞活力。结果 200、300nmol／L浓度的dsRNA能特异有效地阻断Hes5的表达，而50～200nmol／L浓度的dsRNA有利于干细胞存活。结论 dsRNA能在神经干细胞内启动RNA干扰作用，适宜浓度的dsRNA能在特异有效地阻断内源性基因的表达的同时，最大限度地保持细胞活力。

核受体相关因子1基因转染骨髓源性神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元的分化

背景:核受体相关因子1基因修饰是否促进骨髓源性神经干细胞向多巴胺能神经元分化少见报道。目的:观察核受体相关因子1基因修饰骨髓源性神经干细胞在体外诱导分化为多巴胺能神经元的作用。方法:体外培养和纯化大鼠骨髓源性神经干细胞,将骨髓源性神经干细胞分为4组,将未转染的骨髓源性神经干细胞随机分为对照组,脑源性神经营养因子组;将筛选出的重组质粒转染阳性的神经干细胞分为核受体相关因子1组和核受体相关因子1+脑源性神经营养因子组。结果与结论:RT-PCR显示转染的骨髓源性神经干细胞4d后核受体相关因子1高表达,分化结果显示:核受体相关因子1+脑源性神经营养因子组细胞内酪氨酸羟化酶在mRNA水平上的表达量最高,神经干细胞贴壁分化后各组酪氨酸羟化酶阳性细胞比例均明显高于对照组,其中以核受体相关因子1+脑源性神经营养因子组分化比例最高,为(52.44±15.9)%。提示核受体相关因子1基因修饰可促进骨髓源性神经干细胞向多巴胺能神经元分化,并通过脑源性神经营养因子的诱导作用,在体外可获得大量的多巴胺能神经元。

成人骨髓源性神经干细胞的致瘤性研究

目的研究体外培养的成人骨髓源性神经干细胞的致瘤性。方法对骨髓源性神经干细胞分别进行细胞形态学观察、刀豆球蛋白A凝集试验和双层软琼脂培养以探明其是否具有恶性转化细胞的形态特征、表面结构及生长特性的变化;利用免疫细胞化学的方法检测骨髓源性神经干细胞的端粒酶和肿瘤相关基因的表达;将骨髓源性神经干细胞接种到裸鼠体内观察其成瘤性。结果骨髓源性神经干细胞不具有恶性转化细胞的形态特征,在不同刀豆球蛋白A浓度下均未见明显的凝集反应,在双层软琼脂不能形成细胞克隆;骨髓源性神经干细胞的c-myc、c-fos和p53基因均呈阴性表达,而端粒酶逆转录酶呈弱阳性表达;将骨髓源性神经干细胞接种于裸鼠皮下6个月未见肿瘤形成,亦未见其它组织形成。结论骨髓源性神经干细胞保持了正常细胞的生物学特征,体内和体外的各项指标均未提示其具有致瘤性,体外的培养条件没有使其发生恶性转化,从致瘤性方面证实了骨髓源性神经干细胞临床移植的安全性。

骨髓源性神经干细胞体外培养体系的安全性评价

目的评价成人骨髓源性神经干细胞体外培养体系的安全性。方法对骨髓源性神经干细胞的培养上清分别进行无菌试验、支原体检测、热原质检测和异常毒性试验。结果骨髓源性神经干细胞的培养上清经培养无细菌和真菌生长,PCR检测未扩增出支原体的特异性片断,培养上清的热原质含量符合规定的限度,进行异常毒性试验的动物在观察期内未出现局部和全身异常反应。结论骨髓源性神经干细胞的培养体系中不含有对人体移植具有潜在危害的因素,整个培养流程和培养体系是安全可靠的。

体外培养骨髓源性神经干细胞的细胞遗传学分析

目的评价体外培养的成人骨髓源性神经干细胞的遗传稳定性。方法制备骨髓源性神经干细胞的染色体标本,以常规染色和G显带进行染色体的核型分析。结果体外培养的成人骨髓源性神经干细胞的染色体数目为正常人类的46条染色体,未见非整倍体染色体像;G显带图像核型分析显示其为二倍体正常核型,染色体中未发现有缺失、倒位、易位、双着丝粒和环状染色体等结构异常。结论体外培养分化形成的骨髓源性神经干细胞保持了遗传学上的稳定性,为其进一步的临床应用提供了实验依据。

食蟹猴骨髓源性神经干细胞自体脑内移植的研究

目的探讨食蟹猴自体骨髓基质细胞诱导分化成神经干细胞后移植到脑内的生长情况.方法对6只食蟹猴进行骨髓基质干细胞体外培养、诱导分化成神经干细胞,经BrdU标记后进行自体脑移植.动物分为即时移植组和延迟移植组,采用立体定向多点注射的方法将神经干细胞悬液移植到猴皮层创伤灶.结果HE染色显示即时移植和延迟移植的创伤区细胞数量都明显多于假移植治疗对照;免疫组织化学染色显示两组动物在干细胞移植后1～6个月脑皮层创伤灶内均有BrdU阳性表达细胞,移植后半年的动物在移植区邻近的脑白质内也可观察到有BrdU阳性表达的细胞,而创伤对照动物、假移植治疗动物和正常脑组织中则未见BrdU阳性表达. 结论BMSCs体外培养得到的神经干细胞经过自体移植能在脑皮层内存活,并且能增殖、分化和迁移,可成为神经干细胞的替代细胞或来源细胞;干细胞移植到陈旧性的脑皮层损伤灶也具有成活、增殖和迁移能力.

Nurr1基因在体外培养大鼠骨髓源性神经干细胞的表达

目的获得表达孤儿核受体(Nurr1)基因的骨髓源性神经干细胞(BMSCs-NSCs)。方法构建携带Nurr1基因的重组腺相关病毒(AAV)载体AAV-pcDNA3.1-Nurr1,提取质粒,用脂质体转染法转染大鼠BMSCs-NSCs,并用RT-PCR和免疫细胞化学方法检测阳性细胞。结果经酶切鉴定和DNA测序,证实得到了序列正确的重组pAAV-Nurr1,获得了Nurr1阳性的BMSCs-NSCs。结论重组AAV携带的Nurr1基因能够在BMSCs-NSCs中表达,本研究为进一步探讨将该基因工程细胞用于帕金森病基因治疗提供了可能性。

发育期癫大鼠移植骨髓源性神经干细胞对海马BDNF和bFGF表达的影响

目的将骨髓源性神经干细胞(BMSCs)移植到发育期癫大鼠海马区,观察大鼠海马脑源性神经营养因子(BDNF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)表达的变化。方法选择21日龄发育期大鼠,分离大鼠骨髓基质细胞,在特定条件下培养使其诱导分化为神经干细胞(NSC)。建立戊四氮(PTZ)点燃癫大鼠模型,将BMSCs经侧脑室注射移植至癫大鼠海马区;侧脑室注射磷酸缓冲液(PBS)作为对照。分为4组(均n=8):对照组(无癫发作),PTZ致组(癫造模,无治疗),假手术组(癫+PBS侧脑室注射),治疗组(癫+NSC侧脑室注射)。于3、7和14 d处理后用免疫组化法检测大鼠海马区BDNF和bFGF表达。结果致组大鼠海马区(齿状回、CA1区)BDNF和bFGF表达较对照组增加(P<0.05),治疗组海马区(齿状回、CA1区)BDNF和bFGF表达较假手术组也有所增加(P<0.05)。结论 BMSCs移植可以增加PTZ致大鼠海马BDNF和bFGF表达,从而发挥对癫后脑损伤的保护作用。

IL-6促进骨髓源性神经干细胞增殖的实验研究

目的研究白细胞介素6(IL-6)及其受体对体外培养的大鼠骨髓源性神经干细胞增殖的影响及信号转导机制。方法采用密度梯度离心法分离骨髓基质细胞,应用特制的神经干细胞培养基诱导培养6d后收集贴壁细胞传代培养,用AlamarBlue摄入法检测不同浓度的IL-6及IL-6受体对大鼠骨髓源性神经干细胞增殖的影响,Westernblot方法检测不同剂量IL-6对干细胞中STAT3表达的影响。结果IL-6能够促进干细胞的增殖,随着药物剂量的增加,增殖作用明显增加,呈明显剂量依赖性,其中20、100、200ng/mL组均与对照组有显著差异(P<0.01),但2ng/mL与对照组、100ng/mL与200ng/mL组之间无显著差异(P>0.05),20ng/mL与100ng/mL组之间有差异(P<0.05)。IL-6受体可抑制干细胞的增殖,单独应用IL-6受体,100ng/mL、200ng/mL组与对照组均有显著差异(P<0.05)。而IL-6与IL-6受体联合应用可促进干细胞的增殖,但增殖作用比单独应用IL-6组差,两组相比有显著性差异(P<0.05)。随IL-6浓度的增加,干细胞中的STAT3表达增加,20、100、200ng/mL组与对照组相差显著(P<0.01)。结论100ng/mL组的IL-6对骨髓源性神经干细胞有较好的增殖促进作用;IL-6受体可抑制骨髓源性神经干细胞增殖;联合应用IL-6和IL-6受体增殖效果不如单独应用IL-6,提示骨髓源性神经干细胞表面自身具有IL-6受体;IL-6通过增加STAT3表达促进骨髓源性神经干细胞增殖。

成人骨髓源性神经干细胞肿瘤相关基因表达的分析

目的检测成人骨髓源性神经干细胞（Md-NSCs）中肿瘤相关基因的表达情况，评价其致瘤性。方法将体外培养并鉴定过的Md-NSCs作为实验组．以新鲜正常成人骨髓细胞去红细胞作为对照组。用人肿瘤基因芯片检测2组细胞440个肿瘤相关基因的表达：实时定量RT．PCR检测2组细胞癌基因MYC、基质金属蛋白酶2（MMP2）、Notch同源物2motch2）、斯钙素I（STC1）、整合素α3（ITGA3）、信号转导与转录激活因子5b（STAT5b）、Ras同源物基因家族成员C（RhoC）、无翅型小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）整合位点家族成员1（Wnt1）的表达。结果基因芯片检测结果显示，与对照组比较，实验组Md-NSCs中有66个肿瘤相关基因呈高度表达。实时定量RT-PCR检测结果显示，与对照组比较，实验组Md-NSCs中癌基因MYC、MMP2、Notch2、STCl、ITGA3、STAT5b、RhoC、Wnt1均呈高度表达，与基因芯片检测的结果相符。各高度表达基因及其表达倍数分别为：MYC（4．35×10^0）、MMP2（2．84×10^0）、Notch2（2．87×10^0）、STCl（3．41×10^2）、ITGA3（2．22×10^2）、STA1T5b（6．99×10^0）、RhoC（4．92×10^0）、Wnt1（3．64×10^0）。结论大量的肿瘤相关基因在Md-NSCs呈高度表达，其中部分基因的激活已被证实可以促进肿瘤的发生。

异体和自体骨髓源神经干细胞周围神经移植实验研究

[目的]研究异体和自体骨髓源性神经十细胞移植于周围神经后神经修复情况,以及所移植神经干细胞能否以分化神经元的形式存活。[方法]取新西兰人白兔骨髓基质细胞(BMSCS)体外培养及诱导分化为神经干细胞,采用BrdU标记细胞和免疫细胞化学SABC法检测观察培养细胞;随机选择同种异体BMSCS移植、自体BMSCS移植和未移植组。[结果]异体和处自体移植区生K的神经纤维均显波纹状排列,神经纤维密度比正常神经低但形态近似,可见有髓神经纤维的郎飞氏结,可见到神经纤维间隙的黏液基质及少量成纤维细胞,但均未见分化神经元样的细胞存在;未移植侧生K的神经纤维稀疏,可见到比较多的断裂和不连续,基质黏液变明显;异体移植组神经纤维生K的走行序列比自体移植组神经纤维紊乱,可见到反应性增生。[结论]异体和白体骨髓源性神经干细胞周围神经缺损区移植均有利于神经纤维的修复,异体比自体移植后神经纤生长较差但差别较小;本方法神经干细胞朱见以分化神经元的形式存活。

体内和体外调控成人骨髓源性神经干细胞的增殖和分化

近期研究表明神经干细胞（neural stem cells，NSCs）可以通过许多途径培养获得，包括胚胎、胎儿、成人骨髓以及脑组织等。美国希达西奈医学中心Maxine Dunitz神经外科研究所的研究人员之前曾报道了成体大鼠骨髓源性NSCs球的形成，它们在形态和表型上类似于源于脑NSCs的神经细胞球。目前。该研究小组利用成人骨髓源性NSCs，成功地在体外诱导培养出类似于脑源性NSCs的球型细胞团。研究人员掌握了几个加速骨髓源性NSCs生长的基因，可以在体外诱导干细胞的生长与分化。非增殖型重组腺病毒编码cDNA序列类高血糖素免疫反应物（Gli）、重组腺病毒一类高血糖素免疫反应物-1（rADV—Gli-1）、

本期专题：骨髓间充质干细胞的培养基

1无血清神经培养基体外培养大鼠骨髓源性神经干细胞，见2010年14卷19期3441页。 2体外无血清培养基条件下诱导人骨髓基质细胞为神经干细胞的特征．见2007年11卷20期4048页。

神经生物学

大鼠纹状体边缘区和海马空间学习功能比较的研究；脂质体介导的VEGF质粒脑室内注射促进缺血再灌注损伤大鼠脑的修复；DNA修复蛋白PARP在大鼠脑缺血再灌注损伤中的表达时程观察；慢性锂处理对大鼠海马NOS表达的影响；成年大鼠纹状体海人藻酸损伤后nestin的表达；丙戊酸钠影响癫痫大鼠脑细胞凋亡的剂量；帕金森病患者血浆同型半胱氨酸水平及其代谢相关酶基因多态性分析；帕金森病MPTP处理小鼠下丘脑和海马IL-1β和IL-6水平变化；胶质瘤细胞端粒结合因子与ING1基因表达关系的研究；转染XRCC3基因的人脑胶质瘤细胞增加烷化剂类抗癌药耐药性；p53基因对胶质瘤细胞系U251生长抑制作用的研究；星形胶质细胞瘤中PTEN、P16及P53蛋白的表达和意义；神经细胞膜NMDA受体蛋白激光共聚焦显微镜亚细胞定位研究；癫痫灶中凋亡调控基因Bcl-2和Bax的表达；亚低温治疗犬颅脑枪弹伤后局部脑组织c-jun蛋白的表达；S-100、HLA-DR双阳性树突状细胞在重症肌无力患者胸腺中的变化；骨骼肌25000蛋白分布于Ⅰ型肌纤维；小鼠单纯疱疹病毒Ⅰ型脑内潜伏感染的实验研究；高葡萄糖对施万细胞CGT和GalC表达的影响；宽叶缬草对血管性痴呆小鼠学习记忆及海马区神经元病理学改变的影响；百草枯与lactacystin对黑质细胞协同毒性作用；新霉素联合苯丁酸钠对脑胶质瘤抑制作用的机制研究；氟桂利嗪对杏仁核点燃鼠海马Bax mRNA表达的影响；丙戊酸对癫痫大鼠海马兴奋性氨基酸类神经递质动态释放的影响；成人骨髓源性神经干细胞的致瘤性研究；体外培骨髓养源性神经干细胞的细胞遗传学分析；骨髓基质细胞分泌物促进PC12细胞的分化和存活；大鼠免疫细胞及器官的固有胆碱能系统；大鼠脑积水模型的建立；S100β与血管性认知损害的关系。

神经干细胞移植联合康复训练对脊髓损伤大鼠Nogo—A及NgR蛋白表达的影响

目的观察神经干细胞移植联合康复训练对脊髓损伤大鼠Nogo-A及NgR蛋白表达的影响。方法共选取80只SD大鼠，采用改良Allen法制成大鼠T10节段脊髓损伤模型，将其随机分为联合治疗组、细胞移植组、康复训练组及模型组。联合治疗组及康复训练组于制模后次日给予滚筒训练与跑台训练，每周训练5d；联合治疗组与细胞移植组于造模后第7天时，将体外培养的骨髓源性神经干细胞移植人大鼠受损脊髓中。每周采用BBB评分法对各组大鼠后肢运动功能进行评定；于干细胞移植后第1，3，7天时每组各取5只大鼠处死，采用Western—blot法检测各组大鼠术后不同时间点脊髓中Nogo．A及NgR蛋白表达。结果从脊髓损伤后第2周开始，发现联合治疗组大鼠BBB评分在各时间点均明显优于其他各组（P〈0．05），第5周时康复训练组BBB评分明显优于模型组（P〈0．05）。随着时间推移，各组大鼠Nogo—A及NgR蛋白起始均呈现高表达、随后快速下降等特点，以干细胞移植第7天时联合治疗组的降低幅度最显著，细胞移植组次之，康复训练组与模型组间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论康复训练联合神经干细胞移植治疗脊髓损伤大鼠具有协同效应，能进一步抑制受损脊髓中Nogo—A、NgR蛋白表达，促进脊髓损伤大鼠肢体功能恢复。