自体骨髓源性肝干细胞移植治疗肝炎后肝硬化的临床研究

目的探索自体骨髓源性肝干细胞在体外诱导与扩增后肝内移植治疗肝炎后肝硬化的效果。方法选取2008年6月至2009年4月入住我科的肝炎后肝硬化、门脉高压症,并在我科接受了脾切除、门奇静脉断流术治疗的患者12例。治疗组6例,采集并分离自体骨髓源性肝干细胞,在体外培养诱导与扩增7天后,收集细胞在接受脾切除、门奇静脉断流术中经肝固有动脉注入法将其移植至肝内;对照组6例,以同样方法注入等体积生理盐水。通过术前术后患者肝功能及肝纤维化的指标来评估治疗的效果。结果两组病人的术后均未发现手术并发症,术前的各项检验均无统计学差异,术后治疗组肝功能指标谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、血浆白蛋白、凝血酶原时间;肝纤维化指标:透明质酸、人III型前胶原,均好转:对照组未见明显变化,治疗组优于对照组(P<0.05)。结论自体骨髓肝干细胞体外培养诱导与扩增后肝内移植是一种安全有效的肝病治疗方法,可以显著改善肝炎后肝硬化患者肝功能及肝纤维化的指标。

腺病毒介导的白介素10基因体外转导大鼠β_2m-/Thy-1^+骨髓源性肝干细胞

目的研究腺病毒介导的白介素10(interleukin 10,IL-10)基因(AdIL-10)体外转导β2m-/Thy-1+骨髓源性肝干细胞(bonemarrow-derived liver stem cell,BDLSC)的可行性。方法利用免疫磁珠细胞分选(magnetic bead cell sorting,MACS)方法分选大鼠β2m-/Thy-1+BDLSC,RT-PCR法鉴定其肝相关性表型的表达。AdIL-10转导BDLSC,根据腺病毒携带的绿色荧光蛋白表达率测定转导效率,采用RT-PCR法和ELISA法分别检测IL-10的基因表达和蛋白分泌水平。采用MTT法和免疫荧光染色法分别检测腺病毒转导对BDLSC增殖能力和肝细胞样表型白蛋白(albumin,ALB)表达的影响。结果MASC法能成功分选纯化BDLSC,其在基因水平表达肝细胞样表型。AdIL-10转导BDLSC的效率呈剂量依赖性,最佳转染复数为500pfu/cell。AdIL-10修饰BDLSC高表达IL-10基因,且持续高浓度分泌IL-10蛋白至胞外。AdIL-10转导72h后,BDLSC仍保持正常的增殖能力和ALB表达。结论BDLSC是AdIL-10转导的适宜载体,为AdIL-10修饰BDLSC这一新型结合方式用于慢性肝病的治疗奠定了实践基础。

腺病毒介导的人uPA体外转染大鼠骨髓源性肝干细胞的研究

目的评价携带人uPA基因的腺病毒(AduPA)转染骨髓源性肝干细胞(BDLSC)的效率,在BDLSC中的表达及其对BDLSC增殖和分化的影响。方法利用淤胆型肝损伤大鼠模型和含5%淤胆血清病理条件培养液筛选和扩增BDLSC,采用荧光显微镜检测AduPA的转染效率,采用Westernblotting法检测uPA在BDLSC中的表达,采用MTT法和免疫细胞化学法分别检测转染AduPA的BDLSC的增殖和分化变化。结果随着MOI的增高,转染效率明显增高,当MOI为500时,转染效率达92.6±2.2%,转染3天后的人uPA在BDLSC稳定表达,且转染AduPA对BDLSC的增殖和分化无明显影响。结论BDLSC可能是一种良好的基因载体细胞,可携带uPA用于肝纤维化的治疗研究。

IL-10基因修饰骨髓源性肝干细胞移植对肝纤维化大鼠细胞外基质积聚的影响

目的:评价IL-10基因修饰骨髓源性肝干细胞(BDLSCs)移植对肝纤维化大鼠细胞外基质(ECM)积聚的影响.方法:利用免疫磁珠细胞分选(magnetic bead cell sorting,MACS)方法分选大鼠β2m-/Thy-1+BDLSCs.将腺病毒介导的IL-10基因转导至BDLSCs,采用ELISA法检测IL-10蛋白分泌水平.将大鼠随机分为4组:正常组、模型组、BDLSCs组及BDLSCs/IL-10组.采用PCR法检测Y染色体性别决定基因Sry;采用VG染色法观测肝组织胶原沉积面积;Western blot法检测肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达;采用碱水解法检测肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)浓度;ELISA法检测血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)和Ⅲ型前胶原(PCⅢ)等细胞外基质含量.结果:MASC法能成功分选纯化BDLSCs.IL-10修饰BDLSCs持续高浓度分泌IL-10蛋白至胞外,移植后能顺利种植于肝内,减轻胶原沉积,减少α-SMA表达从而抑制肝星状细胞活化,与BDLSCs组比较,BDLSCs/IL-10组大鼠肝组织Hyp水平显著降低(255.0±50.5μg/gvs373.0±26.7μg/g,P<0.01),血清HA,LN及PCⅢ水平也有所降低,差异具有统计学意义(40.5±7.7μg/Lvs79.4±10.3μg/L,61.5±16.4μg/Lvs77.7±12.6μg/L,14.3±0.8μg/Lvs14.9±1.5μg/L,P<0.01或0.05).结论:IL-10基因修饰BDLSCs移植能有效减少肝纤维化大鼠ECM的积聚,为治疗肝纤维化提供了新思路.

焦磷酸测序法检测OCT4启动子在大鼠骨髓源性肝干细胞分化中的甲基化变化

骨髓间充质干细胞具有分化成为肝细胞的潜能已得到证实,但其分化的调控机理还不完全清楚。通过检测大鼠骨髓源性肝干细胞(rat bone marrow-derived liver stem cells,RBMLSCs)诱导分化为肝细胞过程中OCT4启动子甲基化的变化,来探讨启动子甲基化调控细胞分化的机制。RBMLSCs用25μg/L重组人肝细胞生长因子和0.1 nmol/L地塞米松进行诱导,在诱导之后不同时间点(0 d,7 d,14 d)提取细胞的DNA及RNA。用荧光定量PCR法检测白蛋白(albumin,Alb)和OCT4的m RNA表达水平,应用焦磷酸测序法定量检测OCT4基因的启动子中4个Cp G位点的甲基化变化。结果表明:在RBMLSCs分化过程中,Alb m RNA持续增高(P<0.05),但OCT4 m RNA表达在7 d及14 d明显减少(P<0.005);同时OCT4启动子上游的Cp G 1-2-3甲基化频率显著上升(P<0.001),但Cp G 4甲基化无明显变化。这些结果说明OCT4启动子高甲基化可能导致其m RNA表达减少,RBMLSCs多能性消失,但Cp G 4并不参与这一分化调控过程。

肝损伤大鼠骨髓源性肝干细胞的筛选分化与扩增

目的探讨利用肝损伤早期和淤胆血清培养体系从大鼠骨髓细胞中筛选、诱导分化和扩增肝干细胞亚群,以快速、高效地获取骨髓源性肝干细胞。方法建立淤胆型肝损伤大鼠模型和制备含5%淤胆血清病理条件培养液,以促进骨髓源性肝干细胞的体内、外筛选和扩增,采用免疫细胞化学染色和RT-PCR方法检测培养2周时骨髓细胞各种肝干细胞标志表达。结果病理条件培养液培养2周的骨髓细胞形成肝细胞样集落,细胞表达胚胎期肝干细胞特征性蛋白。结论淤胆型肝损伤早期大鼠体内环境和含淤胆血清体外病理微环境可能有效地从骨髓细胞中筛选骨髓源性肝干细胞,从而为临床细胞移植治疗各种肝脏疾病提供种子细胞。

uPA基因修饰骨髓源性肝干细胞移植对肝纤维化大鼠TGF-β-Smads信号通路的影响

目的:探讨尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)基因修饰骨髓源性肝干细胞(BDLSC)移植对CCl4诱导的大鼠肝组织转化生长因子-β-Smads(TGF-β-Smads)信号通路的影响.方法:采用皮下注射CCl4建立大鼠肝纤维化模型.将纯系Fisher大鼠随机分为正常组、模型组、BDLSC组(尾静脉注入2×106BDLSC)和BDLSC-uPA组(尾静脉注入2×106AduPA转染的BDLSC),每组9只.观察各组大鼠肝功能和病理组织学变化;采用免疫组织化学法或Westernblot法分别检测大鼠肝组织TGF-β1、Smad3及Smad7蛋白表达变化.结果:与模型组和BDLSC组相比,BDLSC-uPA组大鼠肝脏结缔组织增生程度减轻,假小叶形成不明显,肝功能明显改善;肝组织TGF-β1蛋白表达明显低于模型组和BDLSC组(0.1849±0.0456vs0.8202±0.0636,0.2936±0.0548,均P<0.05),而Smad3和Smad7蛋白表达无明显变化.结论:uPA基因修饰BDLSC移植可能部分通过抑制TGF-β1蛋白表达,从而发挥抗肝纤维化的作用.

uPA基因转染骨髓源性肝干细胞移植对肝纤维化大鼠HSC活化的影响

目的:探讨尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)基因修饰骨髓源性肝干细胞(BDLSC)移植对CCl4诱导的大鼠肝星状细胞(HSC)激活的影响.方法:大鼠sc400mL/LCCl4造模.36只大鼠随机分为4组:(1)正常组:sc等量橄榄油;(2)模型组;(3)BDLSC组;(4)BDLSC-uPA组,每组9只.各组大鼠于第8周处死,留取血清及肝组织.观察大鼠肝功能的变化;采用免疫组织化学法和Western blot法检测大鼠肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达变化.结果:与模型组和BDLSC组相比,BDLSC-uPA组大鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)和总胆红素(TBIL)水平均有不同程度的降低(86.5±9.7vs187.1±14.8,113.5±15.7;11.5±2.1vs26.3±3.7,17.9±2.8,均P<0.01),血清透明质酸(HA)和Ⅲ型前胶原(PCⅢ)水平明显降低(47.4±10.1vs148.5±22.4,97.6±14.4;18.9±4.4vs39.0±6.1,28.2±4.1,均P<0.01);肝组织α-SMA表达显著下调(0.0174±0.0048vs0.3404±0.0662,0.1080±0.0408,均P<0.01).结论:uPA基因修饰BDLSC移植能有效抑制CCl4诱导的大鼠肝纤维化,改善纤维化大鼠的肝功能,且抑制HSC的活化可能是其抑制肝纤维化的主要机制之一.

骨髓源性肝干细胞的研究进展

近年来干细胞研究取得了很大进展,但是人类胚胎在研究中的应用一直备受争议,因此有关成人体内某些干细胞的受重视程度日益增加.骨髓中的某些干细胞可以演变成为与其组织发育或再生来源无关的细胞类型.卵圆细胞是一种存在于肝脏实质的专能干细胞,研究首先发现了人及动物肝内存在骨髓来源的卵圆细胞,之后体外骨髓干细胞向肝干细胞的成功诱导,使这种现象的存在得到了进一步证实.骨髓干细胞分化为肝干细胞的发现提示他可能参与了体内肝组织细胞的再生及损伤的修复与替代,并为难治性肝病的治疗提供了新的思路.但是,就目前研究状况而言,许多方面尚存在疑问,骨髓源性肝干细胞的临床应用价值如何还有待于进一步研究.

转基因骨髓源性肝干细胞移植对大鼠肝纤维化的影响

目的探讨尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)基因修饰骨髓源性肝干细胞(BDLSC)移植对四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化的影响。方法采用淤胆型肝损伤大鼠模型和含5%淤胆血清的培养液筛选和扩增BDLSC,使用RT-PCR方法检测培养2周时肝干细胞标志表达。体外将携带人uPA基因的腺病毒(AduPA)转染BDLSC并移植入CCl4诱导的肝纤维化大鼠体内,观察大鼠肝功能、胶原面积及病理组织学的变化。结果病理条件培养液培养2周的骨髓细胞形成肝细胞样集落,并表达胚胎期肝干细胞特征性蛋白。体内研究显示,与模型组和BDLSC组相比,BDLSC-uPA组大鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(AKP)及总胆红素(TBIL)水平均有不同程度的降低,凝血酶原时间(PT)时间缩短,白蛋白(ALB)水平升高,肝组织细胞外基质(ECM)水平及羟脯氨酸(Hyp)含量明显降低;肝组织结缔组织增生程度减轻,假小叶形成不明显,胶原面积明显减少。结论uPA基因修饰BDLSC移植能有效抑制CCl4诱导的大鼠肝纤维化,改善纤维化大鼠的肝功能,从而为转基因BDLSC移植治疗肝纤维化的临床应用提供理论依据和实践基础。

骨髓源性肝干细胞的研究进展

肝干细胞用于肝病治疗的研究日益增多,尤其是骨髓分离骨髓源性肝干细胞。文章就骨髓源性肝干细胞的分离、培养、纯化、诱导分化、检测及肝内移植的可能机制和应用前景进行综述。

骨髓源性肝干细胞的研究进展

骨髓干细胞的横向分化/转分化是近年来研究的热点,骨髓源性肝干细胞是在一定条件下能向肝细胞横向分化/转分化的骨髓干细胞,他的发现为肝病治疗带来了新的希望.近年来对骨髓源性肝干细胞的分化机制、分化环境及条件、分离和培养的研究进一步深入,使其在细胞移植、基因治疗等方面有广阔的前景.现就骨髓源性肝干细胞的研究进展及其在临床治疗中应用前景综述如下.

TPO+HGF+IL-3方案对人骨髓源性肝干细胞各亚群体外扩增的促进作用

目的体外观察血小板生成素(TPO)+促肝细胞生长素(HGF)+白细胞介素-3(IL-3)方案对人骨髓源性肝干细胞(BMDLSC)各亚型的增长促进作用。方法实验组为添加有TPO 50 ng/mL、HGF 40μg/mL、IL-3 10 ng/mL的高糖DMEM培养基体系,对照组则不含TPO+HGF+IL-3,分别在第1、7、14天,计算细胞总数,并采用流式细胞技术分别测算表达CD90、CD105、CD117、CD184、CD326的人BMDLSC各亚群的数量变化。结果实验组表达CD90、CD105、CD117、CD184、CD326的人BMDLSC各亚群的扩增倍数在第7天分别为(4.94±0.07)、(4.89±0.06)、(6.70±1.75)、(5.72±0.32)、(5.03±0.05)倍,第14天数量增长倍数为(7.60±0.11)、(7.76±0.16)、(11.70±3.06)、(21.38±1.13)、(8.12±0.13)。结论此方案对人BMDLSC各亚型的体外扩增有明显的促进效果,其中以CD184亚群的扩增效果最为明显。

兔骨髓来源肝细胞修复射频消融肝损伤

目的:探讨骨髓源性肝细胞(BMDH)能否在一定程度上改善肝功能,寻求一种新的肝损伤修复细胞来源和移植途径.方法:新西兰大白兔36只分为3组:假手术组(A),RF手术组(B),RF手术+BMDH移植组(C),每组12只.GFP标记BMDH,植入RF肝损伤再生模型损伤区,手术前、手术后第3,5,7,14日取血测定肝功能,光镜和共聚焦显微镜观测1,2,3wk绿色荧光表达及分布.结果:BMDH可向成骨细胞分化,能表达白蛋白、CK18,具有成熟肝细胞的部分功能.C组较B组肝功能恢复较快,术后3wk仍可见绿色荧光表达.结论:骨髓源性肝细胞可修复RF治疗后肝功能损伤.

大鼠骨髓源性肝干细胞脾内移植后的分化

目的探索大鼠骨髓源性肝干细胞(BDHSC)脾内移植后的分化情况。方法利用肝细胞生长因子(HGF)体外诱导大鼠BDHSC,并植入60只成年SD大鼠脾内,两组(n=30)分别于术后7天和14天处死动物后取脾,RT-PCR及免疫组化检测移植细胞的AFP及白蛋白的表达。结果移植后7天,AFPmRNA、白蛋白mRNA和AFP的阳性表达率分别为73.3%、46.7%、56.7%;移植后14天,AFPmRNA阳性表达率(23.3%)显著下降(P<0.01),白蛋白mRNA阳性表达率(20%)显著下降(P<0.05),AFP阳性表达率(26.7%)亦显著下降(P<0.05)。结论体外诱导大鼠BDHSC脾内移植后。

骨髓来源的肝干细胞研究进展

骨髓干细胞具有自我更新和多向分化的潜能,在体内外的多项实验中证明,部分骨髓干细胞能分化为成熟肝脏细胞,或分泌白蛋白,或具有胆管细胞标志,尤其在受损及遗传缺陷肝脏中分化效率较高。目前有骨髓源性肝干细胞的动员、归巢、转化机制及调控已逐渐成为肝干细胞研究的热点,但仍有许多亟待解决的问题。鉴于骨髓干细胞的易于获得及体外培养技术相对成熟,有望用于肝细胞移植、生物型人工肝及基因载体,在治疗肝脏的感染性、遗传性和代谢性疾病以及肝肿瘤等有广阔的前景。

小鼠骨髓CD90+、CD34+、CD117+和Sca-1+细胞的肝干细胞潜能比较

目的比较的小鼠CD90+Lin-、C34+Lin-、CD117+Lin-和Sca-1+Lin-骨髓细胞的肝干细胞潜能。方法供体为纯系BALB/C雄性小鼠,应用免疫磁珠分选法获取CD90+Lin-、CD34+Lin-、CD117+Lin-和Sca-1+Lin-骨髓细胞。受体为35Gy全肝照射处理后的同龄同系BALB/C雌性小鼠,A、B、C、D组小鼠分别接受CD90+Lin-、CD34+Lin-、CD117+Lin-、Sca-1+Lin-骨髓细胞移植。移植后30天活杀小鼠,取肝进行Y染色体原位分子杂交与白蛋白免疫组织化学联合检测。结果各组小鼠肝组织中都可以检测到Y染色体和白蛋白均呈阳性的双阳性细胞,C组的双阳性细胞数量显著多于其它各组。结论CD90+Lin-、CD34+Lin-、CD117+Lin-、Sca-1+Lin-骨髓细胞都具有肝干细胞潜能,其中CD117+Lin-骨髓细胞的肝干细胞潜能最大、形成肝细胞的能力量强。