沉默NAC-1基因对人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP裸鼠移植瘤化疗敏感的影响

目的:探讨核转录因子NAC-1基因沉默对人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP裸鼠移植瘤化疗敏感性的影响。方法:采用LV4-LUC-GFP慢病毒转染建立NAC-1基因沉默SKOV3/DDP细胞株,将细胞接种到免疫缺陷小鼠皮下,建立人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP裸鼠移植瘤模型,给予顺铂化疗,比较NAC-1基因沉默对SKOV3/DDP在裸鼠体内增殖的影响。取肿瘤组织进行转录组测序,利用Illumina平台进行转录组mRNA测序,筛选差异表达基因,并进行GO和KEGG功能注释和富集分析,揭示NAC-1基因影响移植瘤化疗敏感的可能分子机制。使用STRING数据库构建DEGs编码蛋白互作网络,筛选MCC算法、Degree算法、Closeness算法3种算法共有基因作为关键基因,使用Metascape网站在线分析这些共同基因的基因功能。结果:与对照组相比,抑制NAC-1基因后裸鼠皮下肿瘤体积变小,重量减轻,差异有统计学意义(P<0.05)。转录组学分析显示,抑制NAC-1基因导致肿瘤组织中460个基因显著下调,568个基因显著上调。差异基因(DEGs)在多项GO富集类别中具有显著差异,如细胞代谢、有丝分裂、坏死、炎症、信号传递等。KEGG功能富集结果显示,NAC-1基因沉默可能影响了细胞因子-细胞因子受体相互作用、白细胞跨内皮迁移、神经活性配体-受体相互作用、细胞黏附分子、坏死、ECM受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、NF-κB信号通路等。筛选获得的关键基因主要富集在白细胞介素的信号传导、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)通路、炎症反应等通路。结论:抑制NAC-1基因能提高人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP化疗敏感性,其可能通过多个信号通路影响肿瘤细胞的代谢、增殖、死亡、炎症反应等。

2019—2021年皖南地区地方品种鸡源沙门菌的血清型鉴定、毒力基因和耐药性检测

为了分析皖南地区地方品种鸡(淮南麻黄鸡、淮北麻鸡、霍邱鸡和五华鸡)来源沙门菌的分布、毒力基因和耐药性情况,本试验于2019—2021年采集该地区地方品种鸡养殖场疑似沙门菌感染病死鸡的肝脏组织、肛拭子和死胚等病料组织456份,采用细菌分离培养、形态学观察、生化试验和特异性invA基因的PCR检测进行沙门菌鉴定,采用Kauffmann-White法、PCR法和K-B纸片法分别检测分离菌株的血清型、毒力基因、耐药基因和耐药性。结果显示,共分离得到127株沙门菌,分属于13种血清型,其中以鸡白痢沙门菌、禽伤寒沙门菌和肠炎沙门菌为流行的优势血清型,分别占分离菌株的26.0%、20.5%和17.3%;127株沙门菌中携带的4种毒力基因(spvA、spvB、spvC和spvR)检出率介于7.1%~74.8%,携带的4种毒力岛基因(SPI-1 SPI-2、SPI-3和SPI-5)检出率介于38.6%~81.1%;127株沙门菌对阿莫西林、氨苄西林和磺胺二甲氧嘧啶等8种药物的耐药率介于56.7%~99.2%,以耐10(12.6%)、9(15.0%)和8(20.5%)种药物为主,耐药基因sul 1、sul 2、sul 3、tet(A)、tet(M)和tet(R)检出率介于32.3%~89.8%;经分析,地方品种鸡流行优势血清型与毒力基因和耐药基因均有一定的相关性。结果表明,从安徽省皖南地区4种地方品种鸡中分离的沙门菌具有多种血清型、携带多种毒力基因、耐药性严重,且携带多种耐药基因。

甘肃省食源性单核细胞增生李斯特菌耐药性和基因组特征研究

目的分析甘肃省市售食品中分离的25株单核细胞增生李斯特菌耐药性和基因组特征,为单核细胞增生李斯特菌引起的食源性疾病的防控提供依据。方法以2021—2022年甘肃省市售食品中分离的25株单核细胞增生李斯特菌为研究对象,采用肉汤微量稀释法检测菌株对8种抗菌药物的敏感性,并对菌株进行血清分型和全基因组测序,分析其系统发育谱系、CC型、ST型、血清型、耐药表型及基因、毒力基因、抗性基因、系统发生关系。结果25株单核细胞增生李斯特菌分属谱系Ⅰ、谱系Ⅱ,以谱系Ⅱ为主,共21株(84.0%)。血清型以1/2a为主,共14株(56.0%),分属10个CC型,其中CC9、CC8和CC121为优势CC型,共占56.0%(14株),发现一个新的ST型,即ST3142。仅1株单核细胞增生李斯特菌耐药(4.0%,1/25),为复方磺胺甲恶唑、红霉素、四环素和环丙沙星多重耐药株,本研究菌株耐药表型与耐药基因的携带情况基本一致。25株单核细胞增生李斯特菌均携带LIPI-1和内化素基因,未发现携带LIPI-3的菌株,仅2株ST87型菌株携带LIPI-4。16株菌(64.0%)携带SSI-1,5株ST121携带SSI-2。68.0%(17/25)的菌株inlA基因发生了提前终止(PMSC)。核心基因组多位点序列分型分析能将不同谱系、血清群和CC型的菌株明显分开,25株菌共分为10个亚群,与CC型保持一致。结论甘肃省市售食品中25株单核细胞增生李斯特菌呈现遗传进化多样性,耐药基因及表型均表现出低耐药率,且携带的毒力基因丰富。

1株ST515型多重耐药单增李斯特菌全基因组测序分析

【目的】了解1株分离自调理肉制品的单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)携带耐药基因、毒力基因、可移动元件情况以及遗传进化关系。【方法】以1株从新疆某地的调理肉制品中分离获得的LM菌株LM5567为研究对象,通过VITEK-2 Compact和AST-GP67药敏卡检测LM5567菌株耐药性;经全基因组测序后,对LM5567菌株进行功能注释、分子分型、遗传进化关系和耐药基因、毒力基因及可移动元件携带情况分析。【结果】LM5567菌株对苄青霉素、氨苄西林、苯唑西林、呋喃妥因、复方新诺明、四环素等抗菌药均有耐药性,其基因组全长为2.974 Mb,包含2 941个编码基因。通过GO注释共获得2 144个基因,包含了50种功能特性。多位点序列分型(MLST)分析结果显示,LM5567菌株为ST515型,与分离自不同国家的复合克隆系(clonal complex, CC)CC1菌株具有较近亲缘关系。单核苷酸多态性(SNP)分析表明,LM5567菌株与来自加拿大的菌株02_17924b、02_1103和1株来自波兰的菌株220的突变位点最少,该菌株携带88个毒力基因和6个耐药基因,存在1个转座子Tn6009并携带四环素耐药基因tetM。【结论】食源性LM5567菌株为ST515型多重耐药菌株,基因组携带多种耐药基因、毒力基因和1个转座子,具有发生耐药性转移的潜力,存在通过食物链传播引起人类李斯特菌病的潜在风险。

江苏省2016—2021年临床分离铜绿假单胞菌耐药及基因组特征分析

目的了解江苏地区临床分离的铜绿假单胞菌耐药情况及基因特征。方法收集2016—2021年江苏地区各哨点医院临床分离的铜绿假单胞菌,采用肉汤稀释法对分离株进行10类19种抗菌药物的敏感性测定,对分离株行全基因组测序并多位点序列分型,综合抗菌药物耐药性数据库(CARD)扫描分析耐药基因。结果2016—2021年通过致病菌识别网12个市的哨点医院收集患者分离的铜绿假单胞菌101株。药敏试验结果显示,全部菌株对共计6类8种抗菌药物全部耐药,包括酰胺醇类抗生素氯霉素、磺胺类的复方磺胺甲口恶唑、头孢菌素类的头孢噻肟和头孢唑林、四环素类的四环素、青霉素类的氨苄西林及氨苄西林/舒巴坦以及β-内酰胺类的阿莫西林/克拉维酸;45.54%的分离株为碳青霉烯类耐药菌株,对亚胺培南、美罗培南两种碳青霉烯类抗生素的耐药率已分别达45.54%、39.60%;耐10种以上抗生素的菌株达63.36%;共发现35种耐药表型,其中1株菌对19种抗菌药物广泛耐药,耐药谱为AMC-AM-SAM-CZ-CTX-C-TE-SXT的菌株最多(31.69%,32株)。多位点序列分析发现75个ST型,聚类发现ST 262处于中心点,并遗传进化出11个亚型或分支。全基因组扫描发现6类18种抗菌药物耐药基因,crp P基因的携带情况与表型完全一致。结论2016—2021年江苏地区临床分离的铜绿假单胞菌耐药情况严重,两种碳青霉烯类抗生素的耐药率、耐10种以上抗生素的菌株比例高于国内其他省份,应引起高度重视。

沉默MPZL1调控β-catenin对A549/Tax细胞干性及耐药性的影响

目的探讨髓磷脂蛋白零样蛋白1(MPZL1)沉默后是否通过调控β-catenin表达对A549/Tax耐药性和细胞干性产生影响。方法采用不同浓度阿霉素和紫杉醇处理A549和A549紫杉醇耐药性(A549/Tax)细胞,观察两种细胞的耐药性差异。实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和Western blot检测A549和A549/Tax细胞中MPZL1的表达量差异。对A549/Tax细胞沉默或者过表达MPZL1,进一步将细胞分为对照(control)组、短发卡RNA阴性对照(sh-NC)组、MPZL1沉默(sh-MPZL1)组、过表达阴性对照(OE-NC)组、MPZL1过表达(OE-MPZL1)组,运用细胞计数试剂盒8(CCK-8)和平板克隆实验分别检测MPZL1的表达变化对A549/Tax细胞增殖和克隆形成能力的影响。Western blot检测Wnt/β-catenin抑制剂XAV939和激活剂CHIR-99201处理细胞后,不同蛋白的表达变化。结果A549/Tax细胞对阿霉素和紫杉醇的半数抑制浓度(IC 50)较A549细胞明显增加(P<0.01)。MPZL1在A549/Tax中呈更高的表达趋势。MPZL1敲除后A549/Tax对阿霉素和紫杉醇的IC 50分别为2.731 mg/ml和4.939μg/ml,较阴性对照组的4.541 mg/ml和13.55μg/ml降低(P<0.01)。CCK-8和克隆形成实验结果显示,MPZL1敲除抑制肺癌A549/Tax细胞的增殖活力和克隆形成能力(P<0.05);Western blot结果显示,与阴性对照组相比,MPZL1、肿瘤干性相关蛋白(CD44和CD133)、多药耐药蛋白1(MDR1)、肺耐药相关蛋白(LRP)和β-catenin在sh-MPZL1中的表达水平明显减少(P<0.01)。此外,XAV939可抑制MPZL1、CD44、CD133、MDR1、LRP和β-catenin的表达。CHIR-99201处理细胞后部分逆转敲除MPZL1对上述蛋白的抑制作用。结论MPZL1在肺癌A549/Tax细胞中高表达。敲除MPZL1可抑制肿瘤干性和细胞增殖,增强肺癌A549/Tax细胞对阿霉素和紫杉醇的敏感性。

mcr-1基因阳性禽源性大肠埃希菌耐药基因研究

目的调查鲁中地区禽源性大肠埃希菌mcr-1基因的携带情况,了解mcr-1基因阳性禽源性大肠埃希菌对常用β-内酰胺类药物、氨基糖苷类药物、喹诺酮类药物耐药基因的携带情况,掌握其耐药性。方法收集2020年4月至2021年10月鲁中地区3家大规模养殖场302份健康活鸡、鸭肛拭子新鲜粪便,对分离的大肠埃希菌用聚合酶链反应(PCR)检测mcr-1基因的携带率。对mcr-1阳性大肠埃希菌,采用BD凤凰hoenix TM 100 NMIC/ID-4复合板鉴定菌种及进行药敏试验,采用PCR检测各种β-内酰胺类药物耐药基因、氨基糖苷类修饰酶耐药基因、16S rRNA甲基化酶耐药基因和质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因。结果302份样品中共分离出291株禽源性大肠埃希菌,其中27株携带mcr-1基因,mcr-1基因携带率为9.3%。27株mcr-1基因阳性禽源性大肠埃希菌中:超广谱β-内酰胺酶(ESBL)基因CTX-M-14、CTX-M-15、TEM-1携带率分别为100.00%(27/27)、70.37%(19/27)、74.07%(20/27);质粒介导AmpC酶耐药基因CMY-2携带率为14.81%(4/27);未检出bla SHV、bla DHA、OXA等β-内酰胺类药物相关耐药基因;未检出碳青霉烯酶基因;16S rRNA甲基化酶耐药基因rmtB及氨基糖苷类修饰酶耐药基因aac(6′)-Ⅰb-cr、ant(3″)-Ⅰ的携带率分别为25.93%(7/27)及25.93%(7/27)、92.59%(25/27);喹诺酮类药物耐药基因qnrS的携带率为81.48%(22/27),未检出qnrA、qnrB基因。对多黏菌素B、头孢噻肟、头孢西丁、左氧氟沙星、复方磺胺甲噁唑表现出了100.00%耐药,对头孢吡肟、头孢他啶、氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星和庆大霉素的耐药率分别为85.19%、33.33%、62.96%、14.81%、25.93%和77.78%,未出现对碳青霉烯类药物耐药的菌株。结论禽源性大肠埃希菌mcr-1基因的携带率为9.3%,是引起多黏菌素耐药的主要耐药机制。mcr-1基因阳性禽源性大肠埃希菌同时携带多种耐药基因,表现出多重耐药的特征。

通辽部分地区鸭源大肠杆菌耐药性检测及多重耐药菌株YA-1全基因组测序分析

【目的】大肠杆菌作为家禽最常见细菌性病原之一,其耐药性的不断增强已引起广泛关注。试验旨在了解通辽地区部分鸭场大肠杆菌的耐药性及耐药基因分布,为该地区鸭源大肠杆菌耐药性及耐药基因的研究提供参考。【方法】经16S rRNA测序、生化试验和小鼠致病性试验对送检的通辽市各旗县15份病死鸭肠道样品进行病原菌分离纯化,对分离菌株进行药敏试验及耐药基因的PCR检测,并选取多重耐药菌株进行全基因组测序。【结果】所分离的10株鸭源大肠杆菌均具有不同程度耐药性,对链霉素、环丙沙星、恩诺沙星等药物的耐药率在80%及以上,耐药基因aphA1、strB和qnrS的检出率最高,达到100%。多重耐药菌株YA-1全基因组测序证实,该菌株染色体大小为4 844 827 bp,携带3个完整的质粒,大小分别为144 776 bp(pTLYA-1)、113 584 bp(pTLYA-2)和77 544 bp(pTLYA-3)。分离菌株携带arr-3、aadA16、sul1等70个耐药基因,其中pTLYA-1中携arr-3、dfrA27、aadA16等8个可移动耐药基因,pTLYA-3中携带floR、tetA、sul2等5个可移动耐药基因,pTLYA-2中未发现耐药基因。【结论】由通辽地区部分鸭场分离的鸭源大肠杆菌存在多重耐药性,耐药水平较高,aphA1、strB和qnrS耐药基因普遍流行。

多靶点药物治疗c-ros原癌基因1酪氨酸激酶阳性非小细胞肺癌研究进展

c-ros原癌基因1酪氨酸激酶(ROS1)基因在非小细胞肺癌(NSCLC)中主要与CD74、SLC34A发生融合,其次与SDC4、EZR、TPM3、TFG、ZCCHC8、SLMAP和MYO5C等融合,ROS1融合基因均保留了ROS1的酪氨酸激酶结构域,异常活化时可以激活ROS1酪氨酸激酶区及下游信号通路,导致肿瘤的生长、增殖、迁移和侵袭。ROS1融合阳性NSCLC患者具有发病年龄小、可发生脑转移的特点,我国首次获批用于ROS1融合阳性NSCLC的药物有ROS1酪氨酸激酶抑制剂克唑替尼,但克唑替尼易发生耐药,克唑替尼的耐药机制以及耐药后的ROS1阳性NSCLC如何治疗成为亟需解决的问题,高效、安全的多靶点药物给ROS1阳性NSCLC患者带来曙光。本文就ROS1基因阳性NSCLC的多靶点药物及其耐药机制进行综述。

白介素37下调多药耐药基因-1逆转肺腺癌紫杉醇耐药的研究

目的 本研究旨在探究白介素37(IL-37)在抑制肺腺癌细胞多药耐药性方面的潜在作用,及其对于耐紫杉醇的A549/TAX细胞的影响。方法 通过细胞培养、处理程序、实时荧光定量PCR、Western blot分析和统计学分析等实验方法,系统研究了IL-37对耐紫杉醇A549/TAX细胞的影响。结果 紫杉醇明显抑制了A549和A549/TAX细胞的增殖,其中A549/TAX的耐药指数RI为16.88。100ng/mL的rhIL-37显著抑制了A549/TAX细胞的增殖。在紫杉醇和rhIL-37联合处理组,细胞增殖的抑制率显著高于仅用紫杉醇处理组(P<0.05)。此外,rhIL-37在24小时后显著抑制了A549/TAX细胞的迁移和侵袭。非细胞毒性浓度的rhIL-37也能显著抑制A549/TAX细胞的集落形成。经rhIL-37作用48小时后,A549/TAX细胞中MDR1的表达水平比对照组下降了约66%(P<0.05)。结论 IL-37与紫杉醇联合处理可有效抑制A549/TAX细胞的增殖、迁移和侵袭,同时通过降低MDR1基因的表达水平可能逆转细胞的耐药性,为IL-37在肺腺癌治疗中的潜在应用提供了实验依据。

NOLC1基因在胃癌组织中的表达及其对顺铂耐药性的影响

目的:研究NOLC1在胃癌中的表达量以及与顺铂耐药的相关性。方法:使用肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库对NOLC1在胃癌及正常胃组织表达水平进行评估,应用KaplanMeier生存分析预测NOLC1在胃癌患者中的预后价值。通过免疫组化检测临床胃癌及其癌旁正常标本中NOLC1的表达量。通过持续添加低浓度顺铂诱导构建顺铂耐药株细胞。使用免疫荧光和Westernblot检测耐药型和敏感型细胞中NOLC1表达水平。使用慢病毒构建NOLC1敲低的稳转株胃癌细胞。使用不同浓度的顺铂处理胃癌细胞24h后,通过CCK-8、克隆形成和流式细胞术检测NOLC1对胃癌对顺铂耐药的影响,使用Westernblot检测NOLC1敲低后顺铂诱导的细胞凋亡相关蛋白表达水平。结果:NOLC1基因在胃癌组织中高表达(P<0.01)并且其高表达预示不良预后(P<0.01)。NOLC1在对顺铂耐药的胃癌细胞株中高表达(P<0.01)。敲低NOLC1后,顺铂对胃癌细胞的杀伤能力和增殖抑制效果增强(P<0.05),并且细胞中Cl-Caspase3、Cl-PARP蛋白等凋亡相关蛋白表达上调(P<0.01)。结论:NOLC1蛋白在胃癌中高表达并可以促进胃癌对顺铂的耐受。

GSTP1通过调控STAT3信号通路促进乳腺癌细胞增殖与阿霉素耐药

目的 探讨谷胱甘肽S-转移酶P1(GSTP1)对人乳腺癌MCF-7细胞增殖与阿霉素耐药性的影响及其作用机制。方法 Western blotting检测野生型乳腺癌细胞MCF-7和阿霉素耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR中的GSTP1表达量,通过在MCF-7细胞中转染Flag-GSTP1质粒过表达GSTP1,在MCF-7/ADR细胞中转染GSTP1敲低慢病毒(shGSTP1)干扰GSTP1表达;平板克隆形成实验、CCK-8法和流式细胞术检测转染后乳腺癌细胞的增殖能力、阿霉素耐药性及凋亡水平的变化。Western blotting检测GSTP1表达水平的变化对STAT3通路激活的影响。结果 GSTP1在MCF-7细胞中表达量极低,且显著低于MCF-7/ADR细胞系。GSTP1过表达的MCF-7/ADR细胞克隆形成数量显著多于野生型MCF-7细胞(P<0.05)。过表达GSTP1显著提升了MCF-7细胞的增殖能力,而在MCF-7/ADR细胞系干扰GSTP1表达水平后显著抑制了细胞增殖能力(P<0.05)。CCK-8结果显示,在0.1、1、10、50μmol/ml不同浓度的阿霉素处理下,GSTP1表达水平与MCF-7细胞对阿霉素的耐药性呈正相关(P<0.05)。流式细胞术检测结果显示,GSTP1过表达组(Flag-GSTP1)和对照组(Flag)的凋亡率分别为(11.41±1.16)%和(21.1±1.72)%,GSTP1过表达显著抑制了阿霉素诱导的细胞凋亡(P<0.05)。Western blotting检测结果显示,GSTP1的过表达激活了STAT3信号通路,同时在MCF-7/ADR细胞系中抑制STAT3显著降低了GSTP1的表达水平(P<0.05)。结论 GSTP1通过上调STAT3表达调节乳腺癌细胞MCF-7的增殖能力和对阿霉素的耐药性。

多西他赛或培美曲塞联合铂类对EGFR-TKI耐药的非小细胞肺癌晚期患者外周血PD-1表达水平及淋巴细胞亚群影响分析

目的探究多西他赛或培美曲塞联合铂类对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)耐药的非小细胞肺癌晚期患者外周血程序性死亡受体1(PD-1)表达水平及淋巴细胞亚群的影响。方法回顾性选取2021年3月~2023年4月在如皋市人民医院接受治疗的110例非小细胞肺癌晚期患者。根据不同的治疗方式将患者分为多西他赛组和培美曲塞组,每组各55例。多西他赛组使用多西他赛联合顺铂治疗,培美曲塞组使用培美曲塞联合顺铂治疗,以21 d为1个周期,两组均治疗4个周期。治疗后观察评估两组治疗疗效;比较两组不良反应情况及生活质量情况;观察比较两组CA125、CYFRA21-1、Gal-3水平和PD-1阳性率;比较两组淋巴细胞亚群CD_(3)^(+)、CD_(4)^(+)、CD_(8)^(+)和NK水平。结果多西他赛组疾病控制率(DCR)率92.73%,培美曲塞组DCR率89.09%,两组疾病控制率差异无统计学意义(P>0.05);治疗后培美曲塞组不良反应率显著低于多西他赛组,生活质量改善率显著高于多西他赛组,差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者血清Gal-3、CYFRA21-1、CA125水平和PD-1阳性率治疗前后差值差异无统计学意义(P>0.05);治疗后患者CD3^(+)、CD4^(+)及NK明显提高,差异有统计学意义(P<0.05),而CD8^(+)差异无统计学意义(P>0.05)。结论多西他赛或培美曲塞联合铂类对EGFR-TKI耐药的非小细胞肺癌晚期患者外周血PD-1表达水平及淋巴细胞亚群影响区别无明显差异,但培美曲塞联合顺铂治疗的不良反应发生率比较低,治疗方案更理想,有临床应用价值。

EGFR-TKIs耐药与EGFR突变非小细胞肺癌中PD-L1表达的研究进展

表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂可改善EGFR突变的非小细胞肺癌患者生存期。然而部分患者表现出原发性/获得性耐药,疗效间存在差异。PD-L1表达水平可作为免疫检查点抑制剂治疗的预测性生物标志物,PD-1/PD-L1抑制剂已被批准用于晚期NSCLC的一线治疗。研究表明,部分EGFR突变NSCLC患者免疫治疗效果欠佳,可能与其肿瘤微环境相关。本文就EGFR突变患者的肿瘤微环境与PD-L1的联系、PD-L1在EGFR突变的非小细胞肺癌患者中表达率及与EGFR-TKIs疗效等方面的研究进行综述。

一株定植ST23-K1型耐碳青霉烯高毒力肺炎克雷伯菌的耐药性及全基因组分析

目的分析肺炎克雷伯菌临床分离株K63[第63号耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)]的毒力耐药情况及全基因组特征。方法收集分离自宁夏某医院新生儿重症监护室男性患儿痰液标本的肺炎克雷伯菌K63株,通过VITEK 2 Compact对其进行鉴定和药物敏感性试验。PCR法检测菌株毒力基因(ybtS、iutA、iucA、iroB、rmpA2、fimH、mrkD、peg344)和耐药基因(bla_(TEM)、bla_(SHV)、bla_(NDM)、bla_(IMP)、bla_(OXA-48)、bla_(VIM))。PacBio RSⅢ和illuminate高通量测序平台对其进行全基因组测序、基因组组装及生物信息学分析,获得菌株基因组特征。结果成功从呼吸窘迫和新生儿肺部感染患儿痰液标本中分离出一株CRKP,命名为K63。药敏结果显示其对碳青霉烯类、磺胺类、头孢菌素类、β-内酰胺类、β-内酰胺酶抑制剂复合物等抗生素均耐药。PCR结果显示,毒力基因ybtS、iucA、iutA、rmpA2、iroB、fimH、mrkD、peg344为阳性,同时携带bla_(TEM)、bla_(SHV)、bla_(NDM)及bla_(VIM)耐药基因。全基因组测序及组装得到1条完整的基因组序列及1条质粒序列,其基因组大小为5880871 bp,序列比对结果显示K63菌株为ST23-K1型。在染色体基因组基因鉴定中,发现有8种毒力基因,有7种耐药相关基因。质粒携带有bla_(SHV-66)、bla_(SNDM-5)、sul1、mphA和aph(3’)-Ia、tetC、vanA和mexe等耐药基因。clb(ABCDFGHIJKLMNOPQS)、glf、pilW、ibeB等毒力基因也被注释。同时,水平转移区域预测结果显示质粒pVir-CR-63-1具有转移的潜力。基因富集及功能分析显示主要富集于代谢相关通路。结论分离定植的K63株可能为高毒力耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌,有潜在传播风险,临床上应予以高度重视。

LncRNA SOX2OT靶向SIRT1/自噬通路增强胆管癌细胞5-FU耐药

目的探讨LncRNASOX2OT靶向SIRT1/自噬通路调节胆管癌细胞5-FU耐药的机制。方法将未用5-FU处理HCCC-9810细胞和不同浓度(50、100、150、200μg/mL)5-FU处理的HCCC-9810细胞分为对照组和模型组,qRT-PCR检测LncRNA SOX2OT、SIRT1 mRNA表达水平,Western blot检测SIRT1、Beclin1、LC3和p62蛋白表达。pcDNA3.1-SOX2OT和pcDNA3.1-NC转染HCCC-9810/5-FU耐药细胞,CCK-8检测细胞耐药性,划痕实验检测细胞迁移能力,qRT-PCR检测LncRNASOX2OT、SIRT1 mRNA表达水平,Western blot检测SIRT1、Beclin1、LC3和p62表达。在以上基础上做了Rescue实验,将OV-SOX2OT(2μg/孔)和si-NC(75pmol/孔)、OV-SOX2OT(2μg/孔)和si-SIRT1(75pmol/孔)分别共转染HCCC-9810/5-FU耐药细胞,分组为OV-SOX2OT+si-NC组和OV-SOX2OT+si-SIRT1组,以证明LncRNASOX2OT通过SIRT1影响自噬,并由此影响胆管癌细胞对5-FU的耐药性。RNAPulldown验证SOX2OT与SIRT1的靶向结合关系。结果不同浓度的5-FU均能抑制HCCC-9810细胞增殖(P<0.05)。与对照组相比,模型组SIRT1、Beclin1(P<0.001)和p62(P<0.01)蛋白表达、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值(P<0.001)、SIRT1和LncRNA SOX2OT mRNA水平(P<0.05)均明显增加。与OV-NC组相比,OV-SOX2OT组细胞迁移能力、SIRT1、Beclin1(P<0.001)和p62(P<0.05)蛋白表达、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值(P<0.001)、SIRT1和LncRNASOX2OTmRNA(P<0.05)水平均明显增加。沉默SIRT1表达导致LncRNASOX2OT过表达的HCCC-9810细胞对5-FU的耐药性显著降低。与OV-SOX2OT+si-NC组相比,OV-SOX2OT+si-SIRT1组SIRT1(P<0.001)、p62和Beclin1(P<0.01)蛋白表达、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值(P<0.01)、SIRT1 mRNA(P<0.05)水平均明显降低。RNA Pulldown检测结果显示SOX2OT能够直接与SIRT1结合。结论LncRNA SOX2OT通过上调SIRT1表达促进自噬来增强胆管癌HCCC-9810细胞5-FU耐药性。

PD-L1/PD-L2对食管鳞癌细胞恶性表型的影响及耐药研究

目的探讨程序性死亡配体1/2(PD-L1/PD-L2)对食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及对化疗药物的敏感性。方法在体外食管鳞癌KYSE150细胞系水平上,分别构建PD-L1杂合子敲除细胞系,慢病毒转染PD-L2过表达,将细胞分为WT组(PD-L1野生型)和PD-L1^(+/-)组(PD-L1杂合子敲除)、Ctrl组(对照)和OE-PD-L2组(PD-L2过表达),用RT-qPCR和Western blot验证PD-L1杂合子敲除和慢病毒转染PD-L2过表达效果以用于后续实验。采用EdU、细胞克隆形成实验、Transwell实验检测各组细胞增殖、迁移和侵袭能力。通过CCK8法检测细胞增殖能力并计算抑制率来评估细胞对化疗药物的敏感性。结果与野生型WT组相比,PD-L1^(+/-)组细胞增殖(P<0.001)、迁移(P<0.01)和侵袭能力(P<0.05)明显降低,差异有统计学意义。与Ctrl组相比,OE-PD-L2组细胞增殖和迁移能力增加(P<0.05),而侵袭能力无明显差异(P>0.05)。在顺铂药物梯度浓度干预下,与WT组相比较,PD-L1^(+/-)组细胞增殖活力明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。当顺铂药物浓度为20μmol/L时,与Ctrl组相比,OE-PD-L2组细胞增殖活力无明显变化(P>0.05),而在40μmol/L药物浓度作用下,与Ctrl组相比,OE-PD-L2组细胞增殖活力显著上升,差异有统计学意义(P<0.001)。加入不同浓度的五氟尿嘧啶后发现,与WT组相比,PD-L1^(+/-)组细胞增殖活力显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与Ctrl组相比,OE-PD-L2组细胞增殖活力显著下降(P<0.01)。比较WT组与PD-L1^(+/-)组特异性表达差异的蛋白,共获得25个差异表达蛋白质,其中差异倍数最为显著的上调蛋白为EGFR(Ser1070),下调蛋白为Smad4。结论PD-L1能够促进食管鳞癌细胞的恶性表型;PD-L2可以促进食管鳞癌细胞(ESCC)的增殖和迁移;PD-L1/PD-L2可以影响肿瘤细胞对顺铂和五氟尿嘧啶化疗药物的敏感性。

lncRNA LUCAT1影响自噬促进肺腺癌PC-9/GR细胞对吉非替尼耐药的研究

目的:探索lncRNA LUCAT1对肺腺癌PC-9/GR细胞耐药性的影响,并研究其潜在的耐药机制。方法:CCK-8、克隆形成及Transwell迁移实验检测细胞的药物敏感性、增殖能力、克隆形成能力及迁移能力,qRT-PCR检测细胞中lncRNA LUCAT1的mRNA表达,Western Blot检测自噬关键蛋白p62、Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达,透射电子显微镜观察细胞中自噬小体数量变化。慢病毒转染构建敲低lncRNA LUCAT1和对照组细胞(PC-9/GR-shLUCAT1、PC-9/GR-NC),48 h后荧光显微镜观察慢病毒转染情况,进一步采用qRT-PCR检测敲低LUCAT1转染效果,检测调控LUCAT1前后各组细胞耐药性、克隆及迁移能力的改变,Western Blot实验检测各组细胞自噬关键蛋白表达情况。结果:PC-9/GR细胞较亲本细胞PC-9具有较强耐药性和增殖、迁移能力(P<0.05);PC-9/GR细胞中LUCAT1的mRNA相对表达量高于亲本细胞(P<0.05),并且自噬关键基因LC3-II/LC3-I的蛋白表达量较高,p62蛋白表达较其亲本细胞偏低(P<0.05),而Beclin1蛋白在PC-9/GR和PC-9细胞中表达无明显差异性(P>0.05);PC-9/GR细胞中自噬小体数量明显多于亲本细胞(P<0.05)。敲低LUCAT1后PC-9/GR细胞的耐药性、克隆形成能力及迁移能力均较对照组细胞明显减弱(P<0.05),同时自噬关键基因LC3-II/LC3-I下降、p62蛋白升高(P<0.05)。另外我们发现在PC-9/GR细胞中敲低LUCAT1不影响自噬关键基因Beclin1的蛋白表达(P>0.05),可能在继发性耐药细胞中LUCAT1不是通过影响Beclin1蛋白来调控自噬。结论:肺腺癌PC-9/GR细胞高表达lncRNA LUCAT1及具有高水平自噬,LUCAT1可能通过影响LC3B/p62介导的自噬通路激活自噬进而促进肺腺癌细胞对吉非替尼发生耐药。

lncRNA HIF1A-AS1对长春新碱耐药视网膜母细胞瘤细胞化疗敏感性的影响

目的:探讨长链非编码RNA-HIF1A-AS1(lncRNA HIF1A-AS1)调节缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达对长春新碱(VCR)耐药视网膜母细胞瘤(RB)细胞化疗敏感性的影响。方法:建立人RB VCR耐药细胞株SO-RB50/VCR,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测SO-RB50与SO-RB50/VCR细胞lncRNA HIF1A-AS1表达;在SO-RB50/VCR细胞中抑制lncRNA HIF1A-AS1表达或同时过表达HIF-1α,检测SO-RB50/VCR细胞对VCR的半数抑制浓度(IC_(50))及细胞增殖、凋亡情况;Western blot检测HIF-1α、多药耐药相关蛋白(MRP)、P-糖蛋白(P-gp)蛋白表达。结果:与SO-RB50细胞相比,SO-RB50/VCR细胞中lncRNA HIF1A-AS1与HIF-1α蛋白表达水平升高(P<0.05);在SO-RB50/VCR细胞中抑制lncRNA HIF1A-AS1表达后,细胞凋亡率显著升高(P<0.05),细胞吸光度(OD_(450))值显著降低,VCR对细胞的IC_(50)值及HIF-1α、MRP、P-gp蛋白表达水平显著降低(P<0.05);过表达HIF-1α可减弱下调lncRNA HIF1A-AS1表达对SO-RB50/VCR细胞耐药性的抑制作用。结论:lncRNA HIF1A-AS1在SO-RB50/VCR细胞中高表达,抑制lncRNA HIF1A-AS1表达可通过下调HIF-1α表达,降低SO-RB50/VCR细胞对VCR的耐药性。

2019—2021年宜春地区患者结核分枝杆菌利福平耐药株基因型分析研究

目的:探究2019—2021年宜春地区结核分枝杆菌利福平耐药株基因型。方法:选择2019年1月—2021年12月于宜春市人民医院接受治疗的肺结核患者100例,采集所有患者痰液样本进行检测。分析结核分枝杆菌分离情况及耐药性,另分析利福平耐药株基因型。结果:100例患者中共分离出结核分枝杆菌47株,分离率为47.00%,2019、2020、2021年结核分枝杆菌分离率分别为33.33%、45.95%、54.76%。2019年分离出结核分枝杆菌7株,利福平、异烟肼、链霉素耐药发生率分别为42.86%、28.57%、28.57%;2020年分离出结核分枝杆菌17株,利福平、异烟肼、链霉素耐药发生率分别为58.82%、29.41%、11.76%;2021年分离出结核分枝杆菌23株,利福平、异烟肼、链霉素耐药发生率分别为60.87%、21.74%、17.39%。结核分枝杆菌对利福平耐药率最高。经rpoB基因测序可见27株利福平耐药株均发生rpoB基因变异,基因突变率为100%(27/27),突变基因位点主要位于509~533位。结论:2019—2021年宜春地区结核分枝杆菌感染率呈逐年上升趋势,结核分枝杆菌感染患者对利福平存在较高的耐药性,且rpoB基因位点突变的发生与利福平耐药间存在密切联系。